摘要
目的： 1.将TGF-β3、FGF18进行不同的组合来体外三维成球培养人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs），探索FGF18的最佳加入时机，观察能够最有效的促进HUCMSCs定向分化为软骨细胞并同时抑制肥大表型的培养方案； 2.以透明质酸为基础合成一种光敏感型透明质酸水凝胶，并探究该水凝胶对HUCMSCs的生物相容性，比较在光敏感型透明质酸水凝胶中应用最佳的培养方案进行诱导HUCMSCs成软骨分化是否比单纯体外培养更具有促进作用。 方法： 1.用CCK8检测分别加入TGF-β3、FGF18以及TGF-β3+FGF18后对增殖能力的影响。将传代至第3代的HUCMSCs在15ml离心管中进行三维成球培养，将TGF-β3、FGF18以不同的组合构成软骨诱导体系，具体按照空白组（即未添加TGF-β3、FGF18）、TGF-β3组、FGF18组、TGF-β3+FGF18组、TGF-β3+FGF18（第14天加入）组进行诱导培养21天，采取HE和阿利新蓝染色比较各组细胞外基质的合成和蛋白多糖的分泌，利用实时荧光定量PCR测定各组软骨相关基因COL2A1、COL10A1、SOX9、ACAN的表达。 2.在透明质酸溶液中加入甲基丙烯酸酐并调节PH为8.5，在4℃避光环境中反应24小时使透明质酸甲基丙烯酸酐化，冻干后通过傅立叶变换红外光谱、核磁共振氢谱观察是否成功反应形成甲基丙烯酸酯化透明质酸（Hyaluronate methacrylate,HAMA）。将不同浓度的HAMA溶液加入苯基（2,4,6-三甲基苯甲酰基）磷酸锂盐（Lithium phenyl-2-4-6trimethylbenzoylphosphinate,LAP），用紫外光照射1分钟合成光敏感型透明质酸水凝胶，电镜观察内部结构，万能力学试验机得到应力-应变曲线并计算出压缩模量，检测不同浓度水凝胶的溶胀率。CCK8对比不同浓度水凝胶的细胞毒性，选择毒性最小的浓度和HUCMSCs制成细胞/水凝胶复合体并在第一章实验所得到的最佳诱导方案下培养，同时在相同诱导方案下单纯成球培养，21天后采取HE和阿利新蓝染色比较各组细胞外基质的合成和蛋白多糖的分泌，利用实时荧光定量PCR测定各组软骨相关基因COL2A1、COL10A1、SOX9、ACAN的表达。 结果： 1.CCK8结果发现三种诱导方案均有促增殖作用，而TGF-β3+FGF18组的促进细胞的增殖能力最强。HE和阿利新蓝染色发现TGF-β3组、FGF18组、TGF-β3+FGF18组、TGF-β3+FGF18（第14天加入）组相较于空白组均增加了细胞外基质的合成以及蛋白多糖的分泌，而TGF-β3+FGF18（第14天加入）组的细胞外基质密度最高、蓝染的蛋白多糖最丰富。实时荧光定量PCR显示相对于其他各组，TGF-β3+FGF18（第14天加入）组的软骨分化标志基因COL2A1、SOX9、ACAN的表达明显升高，肥大标志基因COL10A1的表达是最低的，并且P＜0.05，说明该诱导方案既具有促进HUCMSCs向软骨分化的能力又能够抑制软骨肥大分化的趋势。 2.通过傅立叶变换红外光谱、核磁共振氢谱证明已将透明质酸甲基丙烯酸酐化，成功合成了HAMA。通过分别对1%、3%浓度的光敏感透明质酸水凝胶电镜观察发现，3%浓度组整体结构紧密、孔壁四周完整、孔隙密度更大，计算得到3%浓度组的压缩模量更高、溶胀率稍低。CCK8实验证明3%浓度组的吸光度较高，更能促进细胞的增殖能力，因此选取3%浓度光敏感透明质酸水凝胶制备细胞/水凝胶复合体。HE和阿利新蓝染色发现，相较于空白组和单纯成球培养组，细胞/光敏感透明质酸水凝胶组明显细胞外基质更丰富、蓝染部分更多并且许多细胞呈现了软骨细胞的类圆形形态。实时荧光定量PCR显示细胞/光敏感透明质酸水凝胶组软骨分化标志基因COL2A1、SOX9、ACAN的表达明显升高。 结论： 1.在体外三维成球培养HUCMSCs时，一开始就加入TGF-β3，之后在第14天再加入FGF18联合培养的诱导分化方案是最适合的成软骨分化策略，能够达到兼顾促正常分化和抑制肥大分化的效果。 2.HAMA溶液加入LAP后能在紫外光照射下快速合成光敏感透明质酸水凝胶，有着较好的孔隙率、压缩模量、溶胀率和生物相容性。相对于单纯细胞成球培养，同样的诱导分化方案下通过光敏感透明质酸水凝胶包裹HUCMSCs能够更好地促进向软骨分化的能力。
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