摘要
目的： 本论文旨在探究激NEK9与自噬体蛋白LC3的相互作用以及对自噬的调节，并确定NEK9介导的自噬在肺癌细胞增殖迁移以及肿瘤细胞抗药性中的功能，从而探索新的肺癌靶向治疗途径和分子。 方法： 1.采用分子克隆法构建了带MYC标签的NEK9以及NEK9的截断突变体质粒，NEK9-WT（1-979aa）、NEK9-N310（1-310aa）、NEK9-311-750（311-750aa）、和NEK9-C751-979（751-979aa），并在HEK293T细胞中过表达后进行GST-LC3的pull-down实验。同时构建了带有MYC标签的LC3结合缺陷突变体NEK9-L969A/L970A，进行GST-LC3pull-down实验及免疫共沉淀实验。 2.采用慢病毒表达系统在非小细胞肺癌A549细胞中构建NEK9稳定敲低细胞株，采用蛋白质免疫印迹法检测正常培养条件下及自噬激活剂PP242处理后的自噬相关蛋白表达。 3.在A549细胞中构建NEK9直接过表达细胞株NEK9野生型（NEK9-WT）和LC3结合缺陷突变体（NEK9-L969A/L970A）。同时在A549-shNEK9-2#细胞株中构建恢复表达NEK9野生型（shNEK9-2#+NEK9-WT）及其LC3结合缺陷突变体（shNEK9-2#+NEK9-L969A/L970A），采用细胞计数法检测以上细胞株的增殖水平。 4.用抗肿瘤药物Thapsigargin和Tunicamycin处理后观察并统计分析A549细胞直接过表达NEK9野生型细胞株（NEK9-WT）及LC3结合缺陷突变体细胞株（NEK9-L969A/L970A）的药物敏感性差异。 5.用光学显微镜直接和经免疫荧光染色后观察A549-shLUC和A549-shNEK9细胞株在有无饥饿处理条件下的细胞形态变化。 6.采用细胞愈合实验和Transwell小室迁移实验检测A549-shNEK9和A549-shLUC细胞株以及NEK9-WT和LC3结合缺陷突变体NEK9-L969A/L970A过表达细胞株的细胞迁移能力。 结果： 1.GST-LC3pulldown与免疫共沉淀结果表明NEK9能与自噬体蛋白LC3相互作用，并鉴定出NEK9是通过其羧基端的LC3-interactive region（LIR）结构域与LC3结合。 2.敲低NEK9引起肺癌A549细胞中自噬受体蛋白SQSTM1自噬性降解增加，自噬活性增强。 3.敲低及过表达NEK9对肺癌A549细胞的增殖没有显著影响，但过表达NEK9的LC3结合缺陷突变体显著增强肺癌细胞A549对抗肿瘤药物Thapsigargin和Tunicamycin的敏感程度。 4.敲低NEK9引起肺癌A549细胞形态的显著变化，细胞变得平展，面积增大。血清饥饿处理后，NEK9敲低细胞的形态对饥饿敏感性降低。 5.细胞划痕和Transwell实验结果显示，敲低NEK9促进肿瘤细胞迁移。同时过表达NEK9的LC3结合缺陷突变体显著促进肺癌A549细胞的迁移。 结论： 1.NEK9通过羧基端LIR位点与LC3相互作用并调节自噬活性。 2.虽然NEK9对肺癌A549细胞的增殖没有显著影响，但NEK9介导的自噬在A549细胞的抗肿瘤药物应激反应中起重要作用。 3.敲低NEK9使肺癌A549细胞变得平展，面积增大，表明NEK9可能调节细胞骨架。 4.NEK9介导的自噬抑制肺癌细胞的迁移。
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