摘要
目的： 本研究旨在探索CG6015基因在果蝇睾丸生殖干细胞（Germline Stem Cells，GSCs）微环境中的作用，并阐明CG6015基因通过包囊细胞（Cyst cells）介导GSCs分化的调控机制，为阐明人非梗阻性无精子症（Non-Obstructive Azoospermia，NOA）的作用机理提供新思路。 方法: 1.利用UAS-GAL4系统实现果蝇睾丸的细胞特异性敲减，通过免疫荧光染色技术对果蝇睾丸进行形态学分析。 2.利用小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）片段，在果蝇S2细胞中下调CG6015、Downstream of Raf1（Dsor1）和rolled（rl）基因的表达水平。通过荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测CG6015、Dsor1和rl基因的mRNA相对表达水平。运用CCK-8试剂盒检测细胞的生长曲线，利用PH3荧光染色观察细胞的增殖情况，通过TUNEL染色检测细胞凋亡情况，利用流式细胞术评估存活细胞和凋亡细胞的比例。 结果： 1.果蝇免疫荧光染色结果显示，与对照组（Control）相比较，在包囊细胞中敲减CG6015基因后，睾丸的正常形态消失，代之呈现为小睾丸的表型。进一步分析发现，体细胞干细胞（Somatic Cyst Stem Cells，CySCs）和成熟的包囊细胞在Tjgt;CG6015RNAi睾丸中均消失，而未分化的生殖细胞团块大量积累，提示CG6015可以影响CySCs和包囊细胞的维持及生殖细胞的分化过程。此外，敲减CG6015基因导致果蝇睾丸生殖细胞的增殖与凋亡明显失调，且生殖细胞团块中出现磷酸化ERK（double phospho-extracellular regulated protein kinase，dpERK）蛋白的异常表达，提示CG6015基因调控GSCs分化的作用与Epidermal Growth Factor Receptor（EGFR）信号通路相关。 2.在果蝇S2细胞中敲减CG6015基因后，qRT-PCR结果显示，Prp复合亚基和Sm复合亚基的相对mRNA表达水平均上调。CCK-8检测结果提示，siCG6015-1331组细胞的生长能力较阴性对照组（Negative control,NC）显著性下调。免疫荧光染色结果表明，与NC组相比，siCG6015-1331组中PH3阳性细胞的比例明显降低。TUNEL染色结果显示，与NC组相比，siCG6015-1331组中TUNEL阳性细胞比例增高。而流式细胞术检测结果显示，siCG6015-1331组细胞的凋亡比例较NC组增高。以上结果提示，CG6015在S2细胞中能够影响RNA剪接体亚基的表达水平，并参与调节S2细胞的增殖和凋亡过程。 3.果蝇免疫荧光染色结果显示，Dsor1基因在包囊细胞中模拟了CG6015基因的功能，下调Dsor1引起CySCs和包囊细胞的完全缺失，生殖细胞分化过程受到阻滞，并介导小睾丸的形成。而在包囊细胞中敲减rl基因也造成了果蝇睾丸生殖细胞分化受阻。此外，包囊细胞中Dsor1与rl基因表达水平的下调均破坏了dpERK蛋白的正常表达模式。这些研究结果表明，Dsor1和rl基因可能与CG6015基因共同介导了GSCs的分化过程。 4.在果蝇S2细胞中分别沉默Dsor1和rl基因，S2细胞的生长能力明显受限，PH3阳性细胞比例显著性下调，而TUNEL阳性细胞比例显著性升高，流式细胞术检测所得凋亡细胞比例明显上调。 结论： CG6015基因通过EGFR信号通路调控CySCs的维持和GSCs的分化过程，并通过包囊细胞抑制生殖细胞dpERK信号的激活。本研究为探索果蝇睾丸生殖干细胞微环境稳态平衡的调节机理提供了新思路。
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