摘要
肿瘤细胞相比于正常细胞，具有无限复制潜能的特性，因此需要大量的能量供给。Warburg效应显示，即使在氧气充足的条件下，肿瘤细胞表现出更高的糖酵解作用来供给能量，而不是通过产生ATP能力更强的氧化磷酸化的方式，这种能量代谢的重编即“有氧糖酵解”。因此，针对异常能量代谢的治疗被认为是一种有希望的肿瘤治疗策略。然而，目前临床上使用的抗肿瘤药物中，有80%以上都是化学治疗药，具有很强毒副作用和易出现耐药的局限性，相比于化学治疗药物而言，植物药用于抗肿瘤是近年来研究的热点，如紫杉醇和长春新碱以其自身高效低毒的优点被广泛用于临床上抗肿瘤的治疗。倍半萜内酯是首先在菊科植物中发现的一组天然化合物，在这一类化合物中，青蒿琥酯和二甲氨基甲酯目前正在癌症临床试验中进行评估。它们的结构特点吸引了许多研究者的注意力，成为新的抗癌药物的潜在来源。苍耳亭是倍半萜类化合物中研究比较多的一个单体，具有一定的抗肿瘤活性。因此，本研究探讨苍耳亭能否通过调控肿瘤细胞的能量代谢过程产生抗肿瘤作用。 目的: 作为活性倍半萜内酯类化合物，苍耳亭是从植物Xanthium strumarium L.中分离出来的，课题组前期的研究表明它能够通过细胞周期阻滞诱导MKN45和A549肿瘤细胞凋亡产生有效的抗肿瘤作用。本研究目的是探讨苍耳亭能否通过mTOR信号通路调控结肠癌细胞的能量代谢过程，发挥抗肿瘤作用。 方法: 1.体内实验:建立人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型，随机分为模型对照组、5-Fu组、苍耳亭低剂量组（20mg/kg/d）和高剂量组（40mg/kg/d），通过测量瘤体瘤重、免疫组化、Tunnel染色、HE染色等方法检测苍耳亭对裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用。 2.体外实验:采用CFDA SE荧光探针标记法检测苍耳亭对HT-29细胞的增殖的影响，以及划痕实验和Transwell小室检测苍耳亭对HT-29转移能力的影响；通过代谢组学分析苍耳亭对HT-29细胞能量代谢产物的影响；Seahorse XFe96能量代谢分析仪检测苍耳亭对HT-29细胞线粒体压力和糖酵解速率的影响；采用WB和RT-PCR的方法检测苍耳亭对糖酵解过程关键酶和转运体的影响，测定线粒体中氧化呼吸链上的复合物酶的活性实验，测定苍耳亭对氧化磷酸化过程的影响；通过对线粒体进行荧光标记，检测线粒体的质量和超氧化物阴离子的水平，以及RT-PCR法检测线粒体内膜上关键酶TOMM20的表达；最后通过WB和CCK-8以及加入mTOR抑制剂雷帕霉素的等实验方法检测对mTOR信号通路的影响。 结果: 1.苍耳亭能够有效地抑制HT-29人结肠癌细胞的增殖和转移能力 体内动物实验：建立了人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型，随机分为4组给予不同药物治疗。结果发现，苍耳亭（20、40mg/kg/d）能有效抑制裸鼠体内移植瘤的增长，产生明显的抗肿瘤效应。 体外细胞实验：采用CFDA SE荧光标记的方法，发现不同浓度苍耳亭(0、20、30、40μM)处理细胞24小时后，苍耳亭可呈剂量依赖性抑制HT-29细胞的增殖。划痕实验和transwell小室结果发现，与对照组相比，亚致死剂量的苍耳亭（0、5、10、20μM）处理后的HT-29细胞在24h和48h的划痕愈合能力显著降低并且穿透小室的能力明显减弱，这提示倍半萜内酯类化合物苍耳亭可显著降低HT-29细胞的迁移和侵袭能力。 2.苍耳亭抑制ATP的生成调节肿瘤细胞的能量代谢 代谢组学结果和ATP检测试剂盒的检测结果显示苍耳亭(40μM)处理后可显著降低ATP的生成，并且升高糖酵解产物乳酸的含量。这表明苍耳亭对HT-29细胞的能量代谢过程产生了一定的调节作用。 3.苍耳亭抑制HT-29细胞能量代谢中的糖酵解促进氧化磷酸化 首先，通过Seahorse XF96能量代谢分析仪检测到不同浓度的苍耳亭可以降低HT-29细胞中ECAR值和糖酵解能力。蛋白免疫印迹实验和RT-PCR检测结果显示，苍耳亭作用24h可显著降低HT-29细胞Glut1?HK1?MCT4的表达。 其次，通过Seahorse XF96能量代谢分析仪检测到不同浓度的苍耳亭剂量依赖性降低ATP的产生，增加了HT-29细胞中OCR值，促进HT-29细胞氧化呼吸过程。测定HT-29细胞氧化呼吸链上的酶复合物I和酶复合物II的活性，结果表明，相对于对照组，苍耳亭可以显著增加HT-29细胞中酶复合物II的活力。最后，代谢组学分析发现在氧化呼吸链上酶复合物II的代谢底物琥珀酸酯在苍耳亭处理24h后的HT-29细胞中显著降低。 4.苍耳亭诱导HT-29细胞线粒体功能的损伤 Mito-Tracker Green试剂盒检测结果发现苍耳亭能增加HT-29细胞中线粒体数量。氧化磷酸化过程会产生大量的活性氧系，从而对线粒体造成损伤，DHE染色发现与对照组相比苍耳亭处理HT-29细胞24h后，可明显增加细胞内超氧化物阴离子的水平。通过RT-PCR实验检测到，不同浓度的苍耳亭处理24h可明显降低HT-29细胞中TOMM20的mRNA水平，进一步提示苍耳亭对线粒体功能的损伤作用。 5.mTOR信号通路参与苍耳亭对HT-29能量代谢的调控 通过蛋白免疫印迹分析结果观察到，苍耳亭处理HT-29细胞24h，抑制了mTOR的磷酸化、mTOR通路下游蛋白4EBP1的磷酸化，以及cmyc的水平。此外，研究数据表明当苍耳亭与雷帕霉素联合作用后24小时后可协同增加对HT-29的细胞毒作用。 结论: 本研究的结果为苍耳亭诱导HT-29细胞毒性详细机制提供了实验证据，并揭示了苍耳亭作为一种有希望的抗肿瘤化合物，通过调控mTOR/4EBP1信号通路介导的能量代谢过程产生抗肿瘤作用。
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