摘要
聚-3-羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)是一种生物可降解材料，其具有优异的理化性质和生物相容性。目前，PHB在医疗、农业、环保、化工等行业都有广泛的应用前景。二氧化碳(CO2)是一种温室气体，也是一种储量巨大的碳质资源。罗氏真养产碱杆菌(Cupriavidus necatorH16)可以利用CO2为碳源，氢气(H2)为电子供体，在有氧条件下进行生长。当C.necator H16处于生长胁迫条件下时，其会在胞内大量积累PHB。所以通过C.necatorH16可以进行从CO2到PHB的转化，从而同时实现温室气体的利用和可降解材料的生产。但在利用C.necator H16将CO2转化为PHB的过程中，由于该菌在自养生长过程中需要H2和O2，所以必须控制培养系统中O2的含量不能超过H2的爆炸极限(6.9％O2/H2)。这种限氧环境会刺激C.necator H16大量积累PHB，但菌株生长也会受到抑制，并最终导致获得的生物量和PHB产量较低。在上述情况中有两个突出的问题需要解决，首先是限氧条件诱导PHB积累的机制并不明确，其次是限氧条件下细胞生长缓慢严重影响了该菌株的应用。针对这两个问题，本论文利用对比转录组分析技术对高氧(15％O2)和限氧(3％O2)条件下培养的C.necator H16中的中心碳代谢、能量代谢、氧调控关键基因进行了分析。首先通过解析关键代谢途径和过表达氧调控关键基因探究了限氧条件诱导细胞内PHB积累的机制。进而又通过异源表达血红蛋白基因和对PHB合成路径的优化构建了适应于限氧条件下生长和PHB积累的代谢工程菌株。主要研究内容及结果如下: 首先，基于对比转录组结果对C.necator H16的中心碳代谢进行了分析以探寻限氧条件诱导细胞内PHB大量积累的机制。研究结果表明，限氧浓度下细胞内负责编码PHB颗粒表面相蛋白的基因phaP1表达量上调1.8倍，且表达量(RPKM)值大于10000。另外，uspA、rpoN、PHG197等编码调控蛋白的基因在限氧条件下的RPKM值都大于10000。这表明，在限氧条件下PHB颗粒化的加速、乙酰辅酶A的消耗减少及uspA、rpoN、PHG197等调控蛋白的综合调控是限氧条件下细胞内PHB积累量增加的主要原因。 其次，基于对比转录组结果对C.necator H16中一些氧调控相关的关键酶和关键调控蛋白进行了挖掘和过表达验证。研究结果表明，在限氧条件下C.necator H16中NDH-1基因表达量下降削弱了细胞的生长和PHB积累能力。在限氧条件下过表达其亚基D和G后对C.necator H16的生长和PHB积累都有促进作用。另外，在限氧条件下，CRP/FNR家族调控蛋白中的fnr5表达量大幅下调削弱了细胞积累PHB的能力。在限氧条件下过表达fnr5后对C.necator H16的PHB积累有促进作用。 再次，基于对比转录组结果对C.necator H16在限氧条件下生长缓慢的原因进行了探究，并据此对菌株进行了相应的改造。研究结果表明，C.necator H16中产能相关酶的基因表达量显著性下调，细胞内能量供应不足是细胞生长速率降低的主要原因。根据分析结果，通过在C.necator H16中异源表达血红蛋白基因(vgb)后显著的提高细胞在限氧条件下的生物量和PHB积累量。菌株Reh(p2M-pj-v)在限氧条件下自养培养后细胞干重达到0.55g/L，PHB含量达到48.7％，分别比对照组提高了28.8％和26.2％。 最后，基于对比转录组结果对C.necator H16中PHB合成的竞争途径进行了分析，以增强菌株PHB合成能力。研究结果表明，ldh缺失型菌株Reh01在限氧条件下自养培养后胞内PHB积累量提高了10.9％。在此基础上，通过在C.necator H16中敲除ldh并异源表达vgb构建了代谢工程菌株Reh01(p2M-pj-v)。该菌株在限氧自养培养后PHB产量达到0.28g/L，对照组提高了71.6％。 本研究的结果对C.necator H16的基因和调控信息有所补充，为CO2到PHB的转化应用提供了参考。
NETL