摘要
海参隶属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea)，经济种类多数隶属于海参属（Holothuria）和刺参属（Stichopus）两个属。海参具有重要的经济、药用和生态价值，近年来由于人为过度捕捞，使海参野生群体数量急剧下降，目前有多种海参已被列入濒危物种红色名录。因此，通过海参养殖来恢复海参资源显得尤为重要。海参的雌雄辨别能够很大程度上优化人工繁育过程，但是大多数种类的海参在外表上无法分辨雌雄，而且海参性别决定机制方面的研究是空缺的。本研究主要采用基因组学和代谢组学技术对我国华南地区具有重要经济价值和生态价值的两种热带海参——小疣刺参和糙海参的性别差异进行了探究，以期明确两种热带海参的性别决定机制并建立简便快速的性别鉴定方法。 首先采用全基因组测序、组装和比对的方法，对小疣刺参和糙海参进行雌雄差异基因比对，以期找到这两种海参的性别差异基因。小疣刺参的K-mer分析显示，雄性测序深度低于雌性，雄性杂合度高于雌性，初步判断雄性存在异染色质;从糙海参的K-mer分析结果无法判断其性别决定类型，需要重新评估。由于小疣刺参可能具有雄性特异染色质，本研究通过雌、雄基因比对筛选出了一些雌性特异性序列和雄性特异性序列，并分别随机选取雌性和雄性特异性序列各10个，设计引物进行第一轮PCR验证。验证结果显示，所有雌性特异性引物均无法特异地识别雌性个体，而所有的雄性特异性引物均可以特异地识别雄性个体，筛选出扩增效果较好的几条引物继续进行第二轮PCR验证，最后将验证效果最好的一条引物作为分子标记，建立了一种快速鉴定小疣刺参性别的方法，并且成功运用到实践中。 为了进一步了解其他海参的性别差异，并且建立相应的性别鉴定方法，我们基于LC-MS/MS代谢物分析方法，探究了糙海参体腔液中性别特异性代谢物，同时分析了代谢通路的性别差异。结果显示:与雄性糙海参(M)相比，在雌性糙海参(F)的体腔液中共筛选出1352个上调代谢物和943个下调代谢物。根据数据库比对和注释，共筛选出66个具有显著差异的代谢物(P≤0.05，VIP≥1)，其中β-胡萝卜素具有作为性别差异代谢标志物的潜力。研究结果还表明，体腔液中会积累其它器官需求较少的代谢产物，如亚精胺在雌性中浓度较高，而脂肪酸在雄性中种类多且含量较高，这些产物可能在体腔液中行使其他生理功能。另外，还发现雄性体腔液倾向于积累外源物质。通过KEGG进行的代谢通路分析表明，雄性糙海参的性腺发育相关通路——谷胱甘肽代谢、精氨酸脯氨酸代谢、甾类化合物生物合成和酪氨酸代谢均发生在体腔液中;雌、雄糙海参性腺发育受到性激素影响，这种影响可能受到多巴胺的调节并具有性别差异。 此外我们还运用传统的核型分析方法初步探究了糙海参的染色体核型，以期发现异型性染色体，但是实验结果并没有得到理想的染色体中期分裂相，并且观察到的染色体十分短小且呈颗粒状，无法判断着丝粒位置，所以无法找到异型性染色体。 综上所述，本研究首次发现小疣刺参具有雄性特异性序列，推测其可能具有雄性异染色质，其性别决定类型为雄性异配型如XY型，并基于雄性特异序列建立了一种快速鉴定小疣刺参性别的方法;还发现糙海参体腔液中的代谢物具有明显的性别差异，其中雌性体腔液中富集了大量的胡萝卜素，具有作为鉴别性别差异代谢物的潜力，同时发现雄性糙海参更容易积累外源物质。这些研究结果不仅可为海参性别决定机制的研究奠定基础，而且对于优化海参的人工繁育过程、促进海参养殖业的发展将起着积极的推动作用。
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