摘要
微生物来源的天然产物结构复杂、活性多样，是抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药物的重要来源。海洋微生物尤其是深海微生物生活在高盐、寡营养、低温、低光照、低氧的环境条件下，进化出独特的代谢途径和适应机制，具有产生结构新颖，活性显著的天然产物的巨大潜能，从而作为新药研发的一种重要的资源而被重点关注。本课题前期从南海底泥沉积物样品来源的放线菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16中分离得到环肽化合物怡莱霉素（Ilamycins），其对结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv具有显著的抑制活性。本课题以S.atratus SCSIO ZH16为研究对象，针对其代谢产物Ilamycins生物合成过程中的转运和调控蛋白及后修饰酶P450氧化酶的功能表征开展研究，取得如下成果: 1.解析了Ilamycins生物合成过程中4个调控和转运蛋白的功能。通过生物信息学分析，发现了2个调控蛋白（IlaA和IlaB）和2个转运蛋白（IlaJ和IlaK）;通过基因敲除、基因反式回补和过表达实验，确定了调控蛋白IlaA和IlaB在怡莱霉素生物合成过程中的负、正调控作用及转运蛋白IlaJ和IlaK在怡莱霉素生物合成中的转运或提高宿主自抗性的作用，并利用IlaA和IlaB的调控原理，构建了2株Ilamycins高产菌株，相比野生型菌株的怡莱霉素产量提高了1.9倍-3.0倍。此外利用三亲本接合转移技术，实现了Ilamycins基因簇在模式菌株Streptomyces coelicolor M1152中成功表达。 2.前体介导的生物合成在怡莱霉素结构多样化生产中的应用。基于前期对怡莱霉素生物合成机制的认识，利用前体介导的生物合成技术合成了Ilamycins同系物，通过对构建的代谢组分得以简化的2个双基因敲除突变株进行3，5-二硝基-L-酪氨酸的喂养，分离得到5个Ilamycin新同系物。使用7个肿瘤细胞系和2个正常细胞系对Ilamycin同系物进行细胞毒活性测试，活性测试结果表明C45位硝基取代后的Ilamycins新同系物中，diNO2-Ilamycin B1(1)对肝癌细胞系HepG2的活性相比于Ilamycin B1有显著提高，其IC50为8.87±2.92μM;相比于Ilamycin B2的活性，diNO2-Ilamycin B2(2)对乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系HepG2、肺癌细胞系A549和鼻咽癌细胞系CNE的细胞毒活性性均有一定的提高，IC50在30～40μM之间;diNO2-Ilamycin F(3)对乳腺癌细胞系MCF-7的细胞毒活性有显著提高，IC50可达到8.6±0.26μM，但是这些双硝基化的Ilamycins同系物对正常肝细胞系L02的细胞抑制活性也有较大的提高，但对脐静脉内皮细胞系HUVECT的细胞毒活性与其对应的母体化合物相比而言未有太大变化。 3.细胞色素P450氧化酶IlaL和IlaR的体外功能研究。前期对怡莱霉素生物合成基因簇中细胞色素P450编码基因ilaL和ilaR的基因敲除及中间体的分离，得知IlaL是负责怡莱霉素中N-甲基化亮氨酸末端甲基的六电子氧化形成羧基。IlaR负责怡莱霉素中异戊烯基双键(C13-C14)的环氧化。克隆表达了P450氧化酶ilaL和ilaR，以Ilamycin B1，Ilamycin B2为底物时，体外酶反应确证了llaL负责C33位末端亮氨酸甲基的羧基化，并获取了底物Ilamycin B1的Km和Kcat酶动力学参数，分别为6.96±1.63μM和1.205±0.074μM·min-1。同时以Ilamycin B1，Ilamycin E和Ilamycin F为底物时，体外酶反应确证了IlaR负责异戊烯基的环氧化，并获取底物Ilamycin F的Km和Kcat酶动力学参数，分别为149.3±17.74μM和18.1±0.74μM·min-1;此外利用前体介导的生物合成方法及化学半合成法得到的Ilamycins同系物验证了IlaL和IlaR具有较好的底物宽泛性。 综上所述，本研究基于生物信息学分析、通过基因敲除、基因反式回补和过表达实验手段解析调控基因和转运基因在Ilamvcins生物合成过程中的调控转运功能，并利用其调控原理构建了2个Ilamycins高产菌株，并实现了Ilamycins基因簇在模式链霉菌Streptomyces coelicolor M1152中的异源表达;利用前体介导的生物合成技术获得了5个Ilamycins新同系物，部分新衍生物较其母体化合物的抗结核活性和肿瘤细胞毒活性均有不同程度的增强，这不仅丰富了Ilamycins的结构多样性，还为抗结核药物的研发提供了化学实体。此外，本研究还解析了P450氧化酶IlaL和IlaR的体外酶学特征，表征了其酶动力学参数，证实了酶的底物宽泛性，为P450单加氧酶作为催化剂的开发和使用奠定了基础。
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