摘要
珊瑚礁生态系统是全球物种多样性最高、资源最丰富的生态系统之一，被誉为“海洋中的热带雨林”。虫黄藻和造礁石珊瑚之间稳定的互利共生关系是珊瑚在寡营养海水中健康生长、造礁、繁殖的关键，也是维持珊瑚礁生态系统可持续发展的基石。然而，近50年来，在人类活动和全球变化的双重影响下，全球珊瑚礁生态系统受到不同程度的破坏，且处于快速退化中。珊瑚共生虫黄藻的类型组成与珊瑚的环境适应性密切相关，因此通过研究珊瑚共生虫黄藻遗传多样性特征将有助于理解和预测珊瑚礁生态系统未来的发展趋势，而虫黄藻种质资源的获得则可为珊瑚礁生态系统保护及修复相关工作的研究提供物种资源保障。虫黄藻作为甲藻的一支，兼具共生特性，其分离、培养和分类一直是一个世界性难题，在国内更是鲜有报道。基于此，本文以三亚鹿回头造礁石珊瑚为研究对象，开展了珊瑚共生虫黄藻的遗传多样性、分离及溯源、分类鉴定和培养优化研究，主要研究结果如下: (1)采用高通量测序技术，对冬、夏两季三亚鹿回头珊瑚礁区共7属12种111个造礁石珊瑚样品中的共生虫黄藻遗传多样性进行了分析，共检测到Cladocopium（包含C50c、C3u、C15、C1、C21a、C1d、C26、C42a和C17f9个亚系群）、Durusdinium（包含D1、D2d、D2.2和D-no4个亚系群）、Gerakladium（仅包含G3a1个亚系群）3属，其中Cladocopium(Clade C)和Durusdinium(Clade D)是该海域造礁石珊瑚中常见虫黄藻类型，也是主要最优势类型。基于冬、夏两季采样点11个站位的SST、SS、NO3-、NO2-和NH4+数据结果，采用非度量多维尺度法(NMDS)及PREMANOVA统计分析了三亚鹿回头珊瑚礁区不同珊瑚共生虫黄藻系群的环境响应特征，发现环境因子对鹿角珊瑚属珊瑚共生虫黄藻群落组成影响显著，对其他属珊瑚共生虫黄藻群落组成影响不大。 (2)采用f/2培养基（加抗生素和不加抗生素），对11属21种33个造礁石珊瑚样品中的虫黄藻进行分离与培养，结果有6属10种共15个珊瑚样品中出现了运动型虫黄藻，采用毛细管分离法，最终从4属4种共7个珊瑚样品中分离得到了57株虫黄藻纯系。基于系统发育分析，发现57株虫黄藻纯系分属于Symbiodinium(Clade A)、Breviolum(Clade B)、Cladocopium(Clade C)、Durusdinium(Clade D)和Effrenium(Clade E)5属，结合高通量测序结果、珊瑚样品来源及文献分析，初步明确了分离得到的Cladocopium和Durusdinium属虫黄藻主要来源于珊瑚，而Symbiodinium、Breviolum和Effrenium属虫黄藻可能来源于珊瑚礁区海水环境，以营自由生活方式存在于自然环境中。 (3)利用光学显微镜、扫描电子显微镜对分属于Symbiodinium、Breviolum、Cladocopium、Durusdinium和Effrenium5属9株虫黄藻纯系进行了形态学描述，发现虫黄藻藻株细胞形态相近，细胞大小存在一定差别，形态学特征难以作为区分物种的主要证据;进一步采用内部转录间隔区(ITS2)、核糖体大亚基(28S rDNA)、叶绿体核糖体大亚基(23S rDNA)和线粒体细胞色素b基因(cob)、单拷贝微卫星(Sym15)侧翼区、部分光系统ⅡD1蛋白序列(PsbA)和叶绿体非编码区(ncr)的系统发育分析及群体遗传学比较，并结合形态特征及其与宿主的关系，将该研究分离的Symbiodinium sp.藻株鉴定为S.tridacnidorum，Breviolum sp.藻株鉴定为B.minutum，Cladocopium spp.藻株鉴定为C.goreaui，Durusdinium spp.藻株鉴定为D.trenchii,Effrenium spp.藻株鉴定为E.voratum。 (4)以改良f/2培养基为基础培养基，基于响应面法优化了促进E.voratum生长的培养条件，结果发现NaH2PO4·2H2O和FeCl3·6H2O对E.voratum的生物量有显著影响。最佳培养条件为:天然海水添加NaH2PO4·2H2O，0.25mM;FeCl3·6H2O,14.24μM;NaNO3,0.94mM;MgSO4·7H2O,40.63mM;KCl,5.37mM;CaCl2·2H2O,4.08mM;ZnSO4·7H2O,0.35μM;MnSO4,9.93μM;CoSO4，0.36μM。优化后藻细胞干重达到0.76g·L-1，比优化前提高了46％。 鉴于虫黄藻在珊瑚礁生态系统中的重要生态地位，且国内对虫黄藻的分离、培养和鉴定鲜有研究（第一章）。本文通过调查三亚鹿回头造礁石珊瑚共生虫黄藻的遗传多样性，探明了珊瑚共生虫黄藻的组成及影响因素，明确了虫黄藻种质资源状况（第二章）;基于人工培养、系统发育以及高通量测序技术，初步探明了可培养虫黄藻的类型及其与珊瑚的关系（第三章）;运用形态学和分子生物学方法，明确了可培养虫黄藻的分类地位（第四章）;利用响应面法，对其中一株虫黄藻的培养基进行了优化，确定了促进其生长的最优培养条件（第五章）。
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