摘要
生物体的细胞在日常生活中每时每刻都在承受着DNA损伤的压力。紫外照射、电离辐射、DNA复制过程中的错配缺失等因素都会直接导致DNA产生损伤。DNA受到损伤之后基因组会变得不稳定，DNA损伤发生后，细胞会出现周期阻滞，更严重的会导致细胞凋亡。DNA损伤修复也与肿瘤的发生发展有密切的关系，不稳定的基因组会使正常细胞发生癌变。所以DNA损伤修复对于防止细胞发生癌变有着十分重大的意义。目前报道过的参与到DNA损伤修复中的蛋白达450多种，进一步探究并完善DNA损伤修复的机制对于癌症的治疗有着指导性的意义。 RCC2（Regulator of chromosome condensation2）是RCC1家族蛋白中的一员，RCC1家族蛋白包含1个或多个RLD（RCC1like domain）结构，它们分别在核质间物质转运、蛋白质的泛素化调控、细胞周期调控、DNA损伤修复中发挥着重要的作用。我们通过构建质粒，在细胞中表达带有GFP绿色荧光标签的蛋白，对RCC1家族蛋白进行了筛选。我们通过激光辐照诱导细胞产生DNA损伤，成像结果显示RCC2会快速地募集到DNA损伤位点。接着我们用激光诱导DNA损伤，通过免疫荧光实验进一步证实了RCC2在DNA损伤位点处的募集。说明RCC2在细胞的DNA损伤修复过程中或许扮演着十分重要的角色。 RCC2又名TD60(Telophase Disc-60)最初被鉴定为有丝分裂期间的端粒结合蛋白，总长522个氨基酸，含有一个核定位结构域以及一个RLD结构域，在空间上呈七叶螺旋桨结构，在细胞质与细胞核中均有表达。先前的研究报道RCC2在细胞周期的调控，肿瘤的转移中都发挥一定的作用。这些作用也从侧面表示了RCC2在DNA损伤修复中扮演了重要的角色。 通过对活细胞内RCC2募集到DNA损伤位点动态过程的分析，我们发现RCC2快速响应DNA损伤，在30s之内募集到DNA损伤位点，并且能够持续停留在损伤位点。为了探究RCC2具体如何参与到DNA损伤修复，我们首先使用不同种类的化疗药物来处理RCC2敲低的细胞，发现RCC2敲低的细胞对顺铂的耐受性大幅降低。通过蛋白免疫印迹实验我们发现，顺铂处理过的细胞中RCC2的蛋白表达水平明显上升。先前的研究中也报道RCC2与顺铂治疗的耐药性有关。然后我们探究了RCC2对于细胞周期的影响，发现在RCC2敲低的细胞中G1期减少S期增多。接着我们使用双胸苷阻断法将细胞周期同步在G1期与S期交界处，释放药物压力之后观察细胞周期进展的情况，发现在RCC2敲低的细胞中周期进程明显加快。说明RCC2的缺失会影响细胞周期的调控。下一步我们针对RCC2的结构设计了一系列带有GFP标签的突变体D1~D6，通过动态的荧光分析，发现突变体D2、D3在DNA损伤位点处的募集能力明显下降。接着我们在基因缺陷型的小鼠胚胎成纤维细胞模型中分析RCC2募集到DNA损伤位点的情况，发现在PARP1缺陷型的细胞中无法观察到RCC2在DNA损伤位点的募集。使用PARP1抑制剂处理的细胞中RCC2在DNA损伤位点处的募集情况也有所下降。内源性的免疫共沉淀实验结果显示RCC2与PARP1有相互作用。说明PARP1是调控RCC2募集到DNA损伤位点的关键因子。
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