摘要
目的: 肝纤维化（HF）是多种慢性肝损伤的修复反应，也是肝硬化、肝癌等恶性病变的必经阶段。肝星状细胞（HSC）活化是HF发生的中心环节，可引发细胞外基质（ECM）沉积。NADPH氧化酶4（NOX4）产生的活性氧簇（ROS）可调控HSCs中的多种信号通路及相关因子从而影响肝纤维化过程。本次以肝纤维化模型小鼠为研究对象，探究NOX4在肝纤维化组织中的表达水平及作用机制，为肝纤维化的防治提供新的思路。 方法: 选择C57BL/6J小鼠n只（n=30只）分为对照组（n1=10）、模型组（n2=10）、敲除组（n3=10），各10只。模型组（n2）小鼠腹腔按1.6mL·kg-1注射四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化模型，每周2次；敲除组（n3）先利用CRISPR/Cas9技术敲除NOX4基因（敲除后采用Western blot证明肝组织中ASPH蛋白明显缺失，提示敲除成功），然后腹腔注射2ul/g四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化模型，每周2次；对照组（n1）小鼠腹腔注射等量玉米油，每周2次。观察记录各组小鼠生活状态，于建模后第3周，取小鼠股动脉血后处死小鼠取其肝脏，称重比较其肝脏指数变化，采用自动生化仪检测血清ALT、AST含量，采用放射免疫法检测血清透明质酸酶（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）含量。采用Western blot检测三组小鼠肝组织中NOX4、PI3k、Akt蛋白表达水平。采用RT-PCR检测三组小鼠肝组织中NOX4、TGF-β1、SmadmRNA表达水平，采用免疫组化法（S-P）观察NOX4、TGF-β1、Smad在肝组织中的定位表达，采用HE染色和Masson染色观察三组小鼠肝组织病理变化，对三组小鼠纤维化严重程度进行评分，采用RT-PCR检测三组小鼠肝组织中纤维化相关分子α-SMA、CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1mRNA相对表达量。 结果: 血清学检测及放射免疫法检测结果显示，模型组小鼠肝脏指数、ALT、AST及HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平均高于对照组和敲除组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HE染色结果显示，对照组小鼠肝脏组织结构正常，而模型组小鼠肝小叶明显被破坏，显微镜下可见细胞出现水肿、肝索排列紊乱，肿胀变性、坏死和浆细胞浸润，而敲除组小鼠肝脏损伤程度较模型组减轻，肝索排列较整齐，肝小叶被破坏程度也较低，浸润程度降低，水肿情况未见明显变化；Masson染色结果显示，模型组小鼠肝组织中胶原纤维集中在汇管区，且面积较大，数量明显多于敲除组和对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；免疫组化结果显示，NOX4、TGF-β1、Smad阳性表达均呈棕褐色，且主要在肝细胞的胞浆中表达；Ishak肝纤维化评分显示，模型组小鼠肝纤维化评分明显高于敲除组和对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Western blot结果显示，模型组小鼠的NOX4、TGF-β1、Smad蛋白表达水平均高于敲除组、对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；RT-PCR结果显示，模型组小鼠的NOX4、TGF-β1、Smad mRNA及纤维化相关因子α-SMA、CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2mRNA表达水平均高于对照组和敲除组，差异具有统计学意义（P＜0.05)。 结论: NOX4在小鼠肝组织中高表达并具有促纤维化作用，作用机制可能与其能影响生成ROS介导的TGF-β/Smad信号通路及纤维化相关分子α-SMA、CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2表达水平有关，而在缺失NOX4基因的肝纤维化小鼠中肝纤维化程度降低，提示抑制NOX4表达对抗肝纤维化药物研究具有重要意义。
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