摘要
背景 子宫内膜癌在临床上是女性生殖系统较为普遍的恶性肿瘤。尽管子宫内膜癌预后良好，依旧存有大量问题，如晚期、易复发、化疗耐药等。聚ADP-核糖聚合酶（PolyADPRibosePolymerase，PARP）是参与单链DNA损伤修复的关键酶，而PARP抑制剂（PARPinhibitor，PARPi）近几年被开发，PARPi其作用的关键是合成致死效应，当细胞同时存在同源重组修复缺陷（HomologyRecombinationDeficiency，HRD）时，细胞不能修复受损的双链DNA，从而导致基因组稳定性的降低，最终导致细胞的死亡。而研究表明，子宫内膜癌中HRD占到34.4%，同时I型子宫内膜癌中存在约75%的磷酸酶和张力蛋白同源物（PhosphataseandTensinHomologue，PTEN）基因的突变，PTEN可调节HR关键蛋白RAD51的表达，因此PARPi用于子宫内膜癌的治疗具有一定潜力。同时二甲双胍已被证实可作用于磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase，PI3K）相关通路，抑制肿瘤细胞的生长。现有研究已经证实某些PARPi单药以及二甲双胍单药均能够抑制子宫内膜癌细胞，但新型PARPi尼拉帕利对于子宫内膜癌的抑制作用、联合二甲双胍抑制作用以及PTEN突变是否能够增强子宫内膜癌细胞对PARPi治疗的敏感性目前尚不明确。 目的 明确新型PARPi尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及联合用药对子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移的影响并分析作用机制，同时分析联合用药后药物之间的作用关系；通过基因编辑技术构建PTEN突变型子宫内膜癌细胞，进一步确定PTEN突变是否影响子宫内膜癌细胞对尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及联合用药的药物敏感性的变化，有助于我们进一步明确尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及联合用药对子宫内膜癌细胞的抑制作用，为临床治疗子宫内膜癌提供新模式及理论依据。 方法 分别利用尼拉帕利单药、二甲双胍单药和双药联合处理HEC-1B细胞和Ishikawa细胞，并通过CCK-8药物毒性试验、克隆形成实验、AnnexinV凋亡实验、Transwell细胞侵袭、划痕实验观察尼拉帕利单药、二甲双胍单药及联合用药对两种不同的子宫内膜癌细胞系的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并通过Chou-Talalay方法计算CI指数，分析两药之间的作用关系。通过基因编辑敲除PTEN基因，进一步构建PTEN突变HEC-1B细胞，并通过克隆形成实验观察PTEN突变对尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及联合用药的药物敏感性的变化。随后通过Westernblot从蛋白水平检测尼拉帕利单药、二甲双胍单药和联合用药对子宫内膜癌细胞生物学行为、DNA损伤以及同源重组修复相关蛋白表达的影响，对其调控机制做进一步探究。 结果 1.通过CCK-8药物毒性试验、克隆形成实验、AnnexinV凋亡实验、Transwell细胞侵袭实验和划痕实验发现尼拉帕利单药、二甲双胍单药能抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和转移，促进凋亡，且联合用药能够增强上述效果。并通过CI指数发现尼拉帕利和二甲双胍之间存在药物协同作用。 2.蛋白水平发现，尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及双药联合处理后凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、自噬相关蛋白LC-3表达增加，增殖相关蛋白p-Akt、抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低。尼拉帕利单药处理后，RAD51蛋白表达明显增多。二甲双胍单药处理后，RAD51蛋白表达下降。联合用药后细胞RAD51蛋白表达较尼拉帕利单药组下降。而不论尼拉帕利单药还是二甲双胍单药处理后，DNA损伤相关蛋白γ-H2AX表达均升高。 3.成功构建PTEN突变型HEC-1B细胞，并在蛋白水平检测到了PTEN蛋白的缺失。 4.克隆形成实验发现PTEN突变将会增强尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及双药联合对子宫内膜癌细胞增殖抑制作用，但PTEN并不影响双药联合的协同作用。蛋白水平发现，PTEN突变HEC-1B细胞同RAD51蛋白表达下调。 结论 尼拉帕利单药、二甲双胍单药能抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，促进DNA损伤的发生。联合用药存在协同作用，可能与二甲双胍抑制同源重组修复通路关键蛋白RAD51以及尼拉帕利抑制增殖相关蛋白Akt磷酸化有关。PTEN突变能够通过抑制RAD51的表达增强尼拉帕利单药、二甲双胍单药以及联合用药效果。我们的研究可为临床治疗子宫内膜癌提供新思路及理论依据。
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