摘要
目的： 蛋白类生物药物的分析是药物研究中的一项重要内容，对于新药开发具有重要意义。其中，非还原十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳(CE-SDS)方法是分析蛋白类生物药分子大小异构体的有力工具。本论文一方面旨在研究碘乙酰胺(IAM)和N-乙基马来酰亚胺(NEM)等烷基化试剂对重组蛋白X的非还原分析结果的影响，探明出特异性相关杂质形成的机理。与此同时，针对不同分子量的多种多肽和单克隆抗体进行研究，旨在扩大研究对象，以丰富工业界对相关产品的分析表征以及质量控制方面的认识及注意事项。另一方面，利用非还原CE-SDS方法用于蛋白X的位点特异性糖化的分析表征，以研究细胞培养过程中用到的还原糖（如葡萄糖和半乳糖等）对蛋白分子降解的影响，希望利用相关样品及分析技术为业界的生物药生产过程中的质量控制提供研究案例以及技术支持。 方法： 第一部分中，我们利用非还原十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳(CE-SDS)发现了异常的肩峰的形成，并在该技术层面研究了烷基化试剂碘乙酰胺(IAM)和N-乙基马来酰亚胺(NEM)的存在与否、样品孵育时间、样品孵育温度、SDS的存在与否等等方面对结果的影响。随后利用反相色谱技术(RP-HPLC)在亲水疏水性角度对降解后的样品进行了分析，利用MALDI-TOF-MS技术对样品分子量进行了分析，进一步利用液质联用(LC-MS)对蛋白降解物进行分子量大小的分析表征以及利用酶切肽图(PeptideMapping)技术对降解后的蛋白进行了降解位点的分析，利用远紫外圆二色谱(Far-UVCD)技术和内源性荧光光谱检测技术对降解前后的样品进行了高级结构的分析。除此之外，主要利用非还原CE-SDS及RP-HPLC技术对IAM或者NEM作用下的多种多肽及单抗进行分析。第二部分的工作中，主要利用非还原十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳(CE-SDS)技术以及反相液相色谱-质谱联用技术(RP-HPLC-MS/MS)对位点特异性糖化样品的降解情况进行分析。 结果： 第一部分的研究结果表明，碘乙酰胺(IAM)会与重组蛋白X分子中的赖氨酸(Lys)和丝氨酸(Ser)残基发生亲核取代反应，N-乙基马来酰亚胺(NEM)会与重组蛋白X分子中的赖氨酸(Lys)发生亲核加成反应，从而增加了分子量，降低了电泳迁移率，形成肩峰。肩峰杂质的含量显著依赖于样品制备条件，如样品孵育温度、时间、pH及SDS存在与否等等。除此之外，多种不同分子量大小的多肽及单抗等蛋白类样品的分析同样会受到IAM和NEM的相关降解的影响，会在亲水疏水性方面发生显著的降解。第二部分的结果表明，当重组蛋白X在含有葡萄糖和半乳糖等还原糖的体系中孵育一定时间后，其非还原CE-SDS中会形成肩峰，该降解被液质联用及酶切肽图技术证实是其分子中的赖氨酸(Lys)残基与还原糖发生位点特异性反应导致的。 结论： 第一部分研究结果表明，尽管在传统的非还原CE-SDS分析单克隆抗体和其他蛋白时，IAM被广泛地用作烷基化试剂，但蛋白质分子中的赖氨酸(Lys)和丝氨酸(Ser)残基与IAM的烷基化可能会导致额外的杂质峰，从而使分析复杂化。同样，当使用NEM作为烷基化试剂时，赖氨酸(Lys)残基也会发生潜在的降解反应而形成杂质。对多种蛋白类样品，包括多肽、单抗、融合蛋白以及抗体药物偶联物等，其结果也表明会发现潜在降解。因此，在进行非还原CE-SDS等分析之前，必须评估制样过程对分析结果的影响，IAM及NEM的烷基化试剂的使用均需要引起重视。第二部分研究结果表明，在蛋白类生物制品的细胞培养及生产过程中，还原糖的使用不可避免的会造成产品的一定降解，需要对产品充分纯化并可以利用相关技术充分分析及检测产品质量。其中，非还原CE-SDS结合多种其他技术如反相色谱技术以及液质联用等技术，可以发挥一定的作用。
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