摘要
Cas9蛋白是一种由RNA介导的可编程的限制性内切酶，并已经被应用到基因编辑、体内定位成像和疾病模型构建等领域。但是，由于Cas9蛋白存在随机的脱靶效应，会带来不确定的基因突变，这会对生命体造成无法预测的影响，对其应用造成了巨大的限制。Cas9的结合、酶切和解离等一系列的功能都会受到Cas9-sgRNA-DNA三者之间相互作用的调控，所以揭示三者之间的相互作用机制，可以为提高它的靶向能力、降低它的脱靶效应提供更多的思路和方向。 本文利用单分子光镊技术，发现在SpCas9（S.pyogenesCas9）与靶向DNA形成的复合物中，存在两个稳定的蛋白与DNA之间的相互作用位点，这两个位点分别位于前间区附近基序(protospacer-adjacentmotif,PAM)的两端。其中一个作用位点（PAM后相互作用）位于PAM下游大约14个碱基对的位置，其结合强度相对另一作用位点（PAM前相互作用）较弱。然而，当其受到破坏的时，会明显降低Cas9蛋白的结合稳定性。同时，这个作用位点的丢失或被占据都会导致Cas9蛋白的结合和酶切活性大幅度地下降。当解旋酶从PAM下游开始进行解旋并遭遇到dCas9(deadCas9)时，很容易克服PAM后相互作用并使dCas9更快地发生解离，这进一步验证了这一互作位点对Cas9结合稳定性十分重要。然而，当聚合酶从PAM下游开始进行复制时，其反应很容易在dCas9结合的位置被终止，这说明体内不同的马达蛋白对于诱导Cas9的解离有着不同的作用机制。随后，通过突变Cas9中对应互作位置的氨基酸，发现在突变体行使功能的过程中R-loop的形成会受到明显的影响，并通过单分子光镊技术检测到了突变体与DNA之间的相互作用位点的位置发生了改变。此外，实验结果也表明，突变体对由DNAbubble产生的脱靶效应具有更高的敏感性。 综上所述，本文明确了Cas9-sgRNA-DNA三者之间的相互作用的位点及强度，阐明了关键作用位点对Cas9蛋白功能的影响，论证了这些作用位点对Cas9蛋白的具体调控机制，揭示了位于PAM远端的错配对相互作用的影响，探索了体内不同马达分子诱导dCas9解离的动态机制，并进一步通过特定位点氨基酸的突变对Cas9进行了尝试性地优化。这些重要的发现将为进一步优化和改良Cas9技术提供全新的角度和更多的思路。
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