摘要
黑茶是我国特有的发酵茶，按地域主要分为陕西茯砖茶、安化黑茶、云南普洱茶、广西六堡茶、四川康砖茶和贵州边销黑茶等。历史上黑茶因汤色红亮，菌香浓郁、滋味饱满及特有的消脂减腻的保健功效成为西北边疆少数民族日常生活中必不可少的饮品，近年来,逐渐被白领和城市亚健康人群青睐。黑茶独特口感风味和保健功效的形成与黑茶特有的发酵工艺-“渥堆”和“发花”有密切关联，黑茶发酵的实质是众多微生物参与的以粗老鲜茶叶原料为基质进行一系列复杂的生物转化反应,主要有曲霉类、散囊菌、青霉类、芽孢杆菌、酵母及乳酸类，尤其是黑茶中产生的“金花菌”,实际上是一大类散囊菌类,对黑茶品质形成起着关键作用。黑茶独特口感风味的形成离不开渥堆和发花发酵阶段的散囊菌，其代谢产物有很好的抗菌活性、抗氧化活性和抗肿瘤活性等，既可入药也可以用来开发保健产品。目前，各类黑茶中金花菌形态差异较大，分类模糊，亟待系统鉴定分类；黑茶发酵过程中参与的微生物众多，菌株间的相互作用及其作用机制有待解析；黑茶渥堆发酵是开放式自然发酵，受环境及车间小气候影响，以致在黑茶的质量和安全问题上一直争论不休，人工合成益生优势菌群，接种精准调控发酵是解决安全问题及保证黑茶品质的重要途径。 主要研究结果如下： 1、通过对陕西泾阳茯砖茶、湖南安化黑茶、广西六堡茶和云南普洱茶中的散囊菌类进行形态和多基因系统分类结合指纹图谱叠加比对鉴定分析。安化黑茶中分离获得15株散囊菌、陕西泾阳茯砖茶中分离获得6株散囊菌、云南生普洱茶中分离获得3株散囊菌、六堡茶中分离获得3株散囊菌。选择5株具有代表性的散囊菌再结合HPLC指纹图谱在成分水平上对散囊菌进行鉴定分类，在成分鉴定分析时借助蓝光照射（LG）、双氧水诱导（SYS）。分别对Ah5-ZC、Ah6-ZC、Ah7-ZC、Ah9-ZC和LB1-ZC的指纹图谱叠加比对分析，发现Ah5-ZC在RT=4.339min有1个特有吸收峰；Ah9-ZC在RT=35.536min出现1个特有吸收峰、LB1-ZC在RT=2.327min、8.148min两个时间点出现了2特有吸收峰。将蓝光照射培养的Ah5-LG、Ah6-LG、Ah7-LG、Ah9-LG和LB1-LG的指纹图谱叠加比对分析，发现Ah5-LG在RT=22.132min有1个特有吸收峰；发现Ah6-LG在RT=5.853min、7.120min、7.819min、16.526min出现了4个特有吸收峰；Ah9-LG在RT=8.071min、38.141min出现了2个特有吸收峰。将双氧水诱导培养的Ah5-SYS、Ah6-SYS、Ah7-SYS、Ah9-SYS和LB1-SYS的指纹图谱叠加比对分析，Ah9-SYS在RT=6.874min、7.567min、8.672min、9.396min的四个峰的峰面积相比较散囊菌Ah5-SYS、Ah7-SYS、LB1-SYS在对应RT时的峰面积差别明显。将Ah5-LGSYS、Ah6-LGSYS、Ah7-LGSYS、Ah9-LGSYS、LB1-LGSYS的指纹图谱叠加比对分析，发现Ah9-LGSYS在RT=4.452min特有1个吸收峰。 2、通过将阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌、汉逊酵母、酿酒酵母和异常威克汉姆酵母进行共培养筛选，选择了共培养影响效果最明显的阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌组展开系统的研究。将阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌的单培养物、阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌共培养物进行HPLC指纹图谱分析，阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌共培养物中检测出5个新吸收峰，对应的RT时间分别为10.097min、21.690min、22.315min、25.679min、32.472min，在阿姆斯特丹散囊菌或解淀粉芽孢杆菌单培养时没有检测出这些峰。 3、UHPLC-TripleTOF/MS代谢组学技术分析阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌共培养中新化合物的产生。对经过UHPLC-TripleTOF/MS分析后获得的原始数据经表达预处理后共注释到的代谢物有825种，其中有277种代谢物注释到KEGG数据库，662种代谢物注释到的HMDB和Lipidmaps等公共数据库。对注释到HMDB数据库的617种代谢物进行化合物分类统计，617种代谢物分别匹配到13个HMDBsuperclasses中，其中有188种代谢物属于“脂类及类脂分子”，112种代谢物属于“有机酸及其衍生物”，98种代谢物属于“有机杂环化合物”，三者占了所有HMDB注释代谢物的64.50%左右。在Control、CE、CM和CL四组中分别检测到861、864、867和868种代谢物，其中Control、CE、CM和CL分别特有2、1、1和1种代谢物。CE和Control的差异代谢物有263种，其中185种代谢物上调，78种代谢物下调；CM和Control的差异代谢物有238种，其中39种差异代谢物上调，199种差异代谢物下调；CL和Control的差异代谢物有203种，其中170种差异代谢物上调，33种差异代谢物下调。通过对共培养前后差异代谢物的聚类分析以及KEGG通路富集分析，发现共培养前后差异代谢物表达量差异显著，CE和Control组差异代谢物的相关通路包括嘌呤代谢、氰基氨基酸代谢、精氨酸和脯氨酸的代谢、苯丙氨酸代谢、半乳糖代谢、β-丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、嘧啶代谢、组氨酸代谢以及氨酰生物合成、赖氨酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代谢途径。同时，对不同共培养阶段代谢物的变化进行了研究，结果表明不同共培养阶段，代谢物差异亦显著，富集到的相关代谢通路为半乳糖代谢、咖啡因代谢等。 4、本部分以阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌共培养前期（CE）、共培养中期（CM）和共培养后期（CL）为实验组材料，以阿姆斯特丹散囊菌（Control）为对照。通过RNA-seq技术及Illumina测序平台，有40892条Unigene。23709条Unigene序列被注释，其中有12402个Unigenes序列被注释到GO分类的新陈代谢term中，13573条Unigene序列被注释到KEGG分类的新陈代谢分类中。将3个实验样本和对照样本进行两两基因差异表达分析。结果表明，CEvsControl两个样本之间存在3307个差异基因，其中2037个基因显著上调，1270个基因显著下调；CMvsControl两个样本之间存在2623个差异基因，其中只有2393个显著上调基因,230个显著下调基因；在CLvsControl两个样本之间存在1041个差异基因，其中有832个基因显著上调，210个基因显著下调。CL相对于样本Control差异基因最小，CE相对于样本Control差异基因最多。因此将CEvsControl这两个样本进行差异表达基因GO注释和富集分析。在GO富集分析中，显著性富集较强的有：脂质代谢过程、细胞脂质代谢过程、甘油脂代谢过程、甘油脂生物合成过程等。在KEGG富集分类中，显著性富集较强的有：酪氨酸代谢、甘油酯代谢、苯丙氨酸代谢。因此，阿姆斯特丹散囊菌和解淀粉芽孢杆菌共培养对阿姆斯特丹散囊菌的次级代谢产生显著影响，且主要集在中脂质代谢过程、氨基酸代谢两个方面。 5、我们将阿姆斯特丹散囊菌、解淀粉芽孢杆菌、异常威克汉姆酵母、酿酒酵母和汉逊酵母人工合成菌群，融合红茶和黑茶工艺，充分发挥微生物对茶叶成分的生物转化作用，创制了一款新茶饮品，经感官审评，青气消失，琥珀色透亮，回甘好，品质上得到很好的提升。
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