摘要
手足口病(Hand，FootandMouthDisease，HFMD)是一种主要感染5岁以下儿童的全球性急性传染病，尤其在亚太地区广泛流行。目前已鉴定发现20余种肠道病毒感染可导致HFMD，主要病原体为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)，近年来，柯萨奇病毒A组6型(CVA6)的流行率显著升高，在多个地区已成为HFMD暴发流行的优势病原体。然而，目前尚未有CVA6预防性疫苗或特效治疗药物。因此，本研究在前期的工作基础上，应用生物化学和细胞生物学技术开展了CVA6相关研究。 本研究第一部分进行了CVA6特异性中和抗体的筛选，并在体外水平上对其生化性能进行了系统地鉴定。首先，基于病毒衣壳蛋白VP1基因序列对本实验室现有的CVA6毒株进行序列的一致性分析，确定了后续实验所用的代表性毒株，分别为流行株00141（E基因型）和原型株Gdula(A基因型)。然后，应用前期已建立的CVA6病毒规模化制备与纯化体系，制备了纯度较好、浓度较高的CVA6病毒颗粒用于小鼠免疫。接着，本研究通过杂交瘤技术和快速高通量的体外中和试验方法筛选获得了12株CVA6中和单抗，其中抗体4E9能够高效中和CVA6不同亚型毒株的同时也具有较好的结合活性以及免疫优势性。 本研究进一步优化了前期已建立的CVA6小鼠感染模型，确定了CVA6不同亚型毒株的最佳攻毒剂量，并基于此对抗体4E9的体内抗病毒能力进行了系统地评估。首先，对攻毒后一天的小鼠进行不同剂量的4E9单针治疗。结果发现，1μg/g和10μg/g治疗组小鼠能够100％抵抗00141毒株的致死性攻击;10μg/g治疗组对Gdula毒株的保护率为100％，1μg/g治疗组的保护率也高达80％;这表明了中和抗体4E9在小鼠体内具有较好的广谱抗病毒能力。接着，本研究在00141株攻毒的小鼠模型上进行了不同治疗时间和不同治疗频率的抗体疗效评价。结果显示，在攻毒后第2天进行单针10μg/g的治疗，小鼠保护率达80％;并且从攻毒后第2天开始连续治疗三针能够100％保护小鼠免受CVA6的致死性攻击，进一步证实了4E9具有良好的体内抗病毒潜能。 综上所述，本研究成功筛选并获得了12株CVA6特异性的单克隆中和抗体，其中抗体4E9具有高效的广谱中和活性。通过优化原有的CVA6动物感染模型，验证了抗体4E9具备良好的体内抗病毒能力。本研究为预防性疫苗的质控、特效治疗药物设计以及潜在广谱表位的发现提供了重要的研究基础。
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