摘要
本课题研究内容包括二部分内容，第一部分：构建优化的TTF-1启动子核心序列调控miR-7表达真核载体（命名为：p-TTF-1opt-miR-7）；第二部分：观察TTF-1opt启动子调控miR-7表达对人肺癌细胞体内生长的影响。分述如下： 目的： 第一部分：构建不同长度TTF-1启动子调控miR-7表达的真核载体，利用Real-timePCR技术和生物数据库对TTF-1启动子的核心序列进行筛选验证。根据结果利用DNA序列合成和分子克隆技术对TTF-1启动子核心序列进行改造优化，构建优化的TTF-1启动子核心序列调控miR-7表达的真核载体并观察其体外生物学效应。 第二部分：常规建立人肺癌95D裸鼠荷瘤模型，利用Real-timePCR、HE染色、免疫荧光共聚焦和Westernblot等实验技术观察TTF-1opt启动子调控miR-7表达对人肺癌95D裸鼠荷瘤模型肿瘤生长的影响。 方法： 第一部分： 1.在前期构建的p-EGFP-N1-TTF-1-miR-7载体的基础上分别设计并构建不同长度TTF-1启动子调控miR-7表达的真核载体，并将三个不同长度TTF-1启动子调控miR-7表达的真核载体和p-Cont载体分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞，用Real-timePCR技术检测各转染组中miR-7的表达水平，CCK-8实验检测各转染组中95D细胞的增殖能力以筛选TTF-1启动子核心序列调控miR-7表达的真核载体（命名为p-Tcor-miR-7）。 2.进一步利用Signalscan、Matrix和Patch生物数据库对TTF-1启动子核心序列上潜在结合的转录因子进行预测分析；体外培养人肺癌细胞系95D细胞、A549细胞、人正常支气管上皮细胞B2细胞、人乳腺癌MB231细胞和人结肠癌SW620细胞，分别体外瞬时转染p-Tcor-miR-7重组载体；Real-timePCR技术检测miR-7及相关转录因子的表达以筛选调控miR-7表达的核心转录因子。 3.利用DNA序列合成技术对p-Tcor-miR-7上的TTF-1启动子核心序列进行改造，使其形成更多关键转录因子的结合位点；进一步利用分子克隆技术构建优化的TTF-1启动子核心序列调控miR-7表达真核载体（命名为p-optTcor-miR-7）；采用EMSA实验对TTF-1opt启动子核心序列上结合的关键转录因子进行验证。 4.将p-optTcor-miR-7、p-Tcor-miR-7和p-Cont载体分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞，Real-timePCR技术检测各转染组中miR-7的表达水平，CCK-8实验检测各转染组中95D细胞的增殖能力变化；进一步将p-optTcor-miR-7重组载体分别体外瞬时转染六种不同的人类细胞系中，包括人肺癌细胞系95D细胞、A549细胞、人乳腺癌MB231细胞、人结肠癌细胞系SW620细胞、HCT116细胞和人正常支气管上皮细胞B2细胞，利用Real-timePCR技术检测各组细胞中miR-7的表达水平以验证该重组载体调控miR-7表达的靶向性。进一步将p-optTcor-miR-7重组载体和p-Cont载体分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞，通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验检测TTF-1opt启动子调控miR-7表达对人肺癌95D细胞的体外生长、侵袭、迁移和克隆形成能力的影响；流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡和细胞周期的变化；Real-timePCR技术检测肿瘤细胞中生长周期蛋白依赖性激酶CDK1、CDK2、CDK4和CDK6的表达变化，以及转移相关分子MMP2、MMP3、MMP9、CXCR4和E-cadherin的表达变化；最后利用Westernblot技术检测Akt、磷酸化Akt、Erk、磷酸化Erk和NDUFA-4的表达变化水平。 第二部分： 1.建立人肺癌95D裸鼠荷瘤模型，模型建立后，随机分为p-Cont组、p-Tcor-miR-7组和p-optTcor-miR-7组，并每隔3天给予三组荷瘤小鼠进行尾静脉分别注射100mg的p-Cont、p-Tcor-miR-7和p-optTcor-miR-7重组载体，连续注射5次，每3天动态监测并记录三组荷瘤小鼠的肿瘤体积变化，绘制皮下肿瘤生长曲线计算肿瘤抑制率，在末次注射载体3天后将三组荷瘤小鼠麻醉处死。 2.分别取p-Cont组、p-Tcor-miR-7组和p-optTcor-miR-7组荷瘤小鼠的主要脏器和肿瘤组织，HE染色观察其组织病理学变化；Real-timePCR技术检测肿瘤组织中miR-7的表达情况；免疫荧光共聚焦技术检测肿瘤组织中增殖核抗原Ki67的表达；TUNEL法观察肿瘤组织中局部细胞凋亡情况；此外利用Real-timePCR技术检测肿瘤组织的细胞生长周期蛋白依赖性激酶CDK1、CDK2、CDK4和CDK6的表达变化，以及转移相关分子MMP2、MMP3、MMP9、CXCR4和E-cadherin的表达变化；利用Westernblot技术检测Akt、磷酸化Akt、Erk、磷酸化Erk和NDUFA-4的表达变化水平，进一步利用免疫荧光共聚焦技术检测NDUFA-4的表达变化水平；Real-timePCR检测荷瘤小鼠主要脏器中质粒拷贝数的分布和miR-7的表达情况；最后分析荷瘤小鼠主要脏器的HE染色、脏器重量、脏器指数和血糖、血脂相关生化指标Serumtotalcholesterol（TC）、Triglyceride（TG）、Glutamicacid（GLU）、Aspartateaminotransferase（AST）和Alaninetransaminase（ALT）的变化水平以初步评估p-optTcor-miR-7重组载体体内干预治疗的安全性。 结果： 第一部分： 1.首先分别构建不同长度TTF-1启动子调控miR-7表达的真核载体，其中TTF-1启动子的长度分别为1612bp、1212bp和853bp（分别命名为p-T1612-miR-7、p-T1212-miR-7和p-T853-miR-7）；将三个载体和p-Cont载体分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞；Real-timePCR检测结果显示：与p-Cont对照组相比，p-T1212-miR-7载体转染组中miR-7的表达水平显著上调（P＜0.05），而p-T853-miR-7载体转染组中miR-7的表达水平明显下调（P＜0.05）；CCK-8实验检测结果显示：与p-Cont对照组相比，p-T1212-miR-7载体转染组中95D细胞的增殖明显下降（P＜0.05），而p-T853-miR-7载体转染组中95D细胞的增殖变化不显著（P＞0.05），提示启动子上-1212bp至-853bp的序列（共359bp）为TTF-1启动子的核心序列。 2.用Signalscan、Matrix和Patch生物数据库对该TTF-1启动子核心序列上潜在结合的转录因子进行预测分析，筛选出NF-1和AP-1两个转录因子，结合位点分别为-1166bp-1162bp（TGGCA）和-1141bp-1137bp（CCAAG）；体外培养人肺癌细胞系95D细胞、A549细胞、人正常支气管上皮细胞B2细胞、人乳腺癌MB231细胞和人结肠癌SW620细胞分别体外瞬时转染p-T1212-miR-7（为了便利，重命名为p-Tcor-miR-7）重组载体，Real-timePCR检测结果显示：与人正常支气管上皮细胞B2细胞转染组相比，人肺癌95D细胞和A549细胞转染组中miR-7的表达水平最高（P＜0.05），其转录因子NF-1的表达水平也明显高于其他转染组（P＜0.05），且在其他各组中，随着NF-1表达水平的降低，其miR-7的表达水平也逐渐降低，呈现出相同的变化趋势；然而，各组中转录因子AP-1的表达与miR-7的表达间无明显相关趋势，提示转录因子NF-1为结合到TTF-1启动子核心序列上调控miR-7表达的关键转录因子。 3.利用DNA序列合成技术将p-Tcor-miR-7载体上TTF-1启动子核心序列的4个位点（分别为：-1068bp-1064bp位点：TGGCT，-998bp-994bp位点：ATGCA，-952bp-948bp位点：GGGCA，-926bp-922bp位点：TGGCC）突变为转录因子NF-1结合位点TGGCA，以形成更多NF-1的结合位点，并利用分子克隆技术构建优化TTF-1启动子核心序列调控miR-7表达的真核载体p-opt1Tcor-miR-7（TTF-1启动子核心序列上存在三个转录因子NF-1结合位点）和p-opt2Tcor-miR-7（TTF-1启动子核心序列上存在五个转录因子NF-1结合位点）两个重组载体；最后，EMSA实验结果显示：与p-opt1Tcor-miR-7相比，p-opt2Tcor-miR-7的启动子上可结合更多的转录因子NF-1。 4.进一步将p-opt1Tcor-miR-7、p-opt2Tcor-miR-7、p-Tcor-miR-7和p-Cont载体分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞；Real-timePCR检测结果显示:与p-Cont对照组和p-opt1Tcor-miR-7转染组相比，p-opt2Tcor-miR-7转染组中miR-7的表达上调最为显著（P＜0.05）；CCK-8实验检测结果进一步显示：p-opt2Tcor-miR-7转染组中95D细胞的增殖抑制最为明显（P＜0.05）。因此，选择p-opt2Tcor-miR-7重组载体为最优的TTF-1opt启动子调控miR-7表达的真核载体进行后续研究。 5.Real-timePCR检测结果进一步显示：与其他类型肿瘤细胞相比，miR-7在p-opt2Tcor-miR-7重组载体转染组的人肺癌细胞系95D细胞和A549细胞中的表达上调最为明显（P＜0.05）。CCK-8实验检测结果进一步显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7转染组相比，p-opt2Tcor-miR-7转染组中95D细胞的增殖明显下降（P＜0.05）。 6.ScratchAssay实验、Transwell实验和克隆形成实验结果分别显示:与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7转染组相比，p-opt2Tcor-miR-7转染组中95D细胞的迁移能力、侵袭能力和克隆形成能力均显著降低（P＜0.05）；流式细胞术结果显示：各转染组中细胞凋亡比例无明显差异（P＞0.05），但周期分析结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7转染组相比，p-opt2Tcor-miR-7转染组细胞中G0/G1期和G2/M期细胞比例显著上调，而S期细胞比例显著下调（P＜0.05）。Real-timePCR检测结果进一步显示:p-opt2Tcor-miR-7转染组中细胞生长周期蛋白依赖性激酶CDK1、CDK2、CDK4和CDK6以及转移相关分子MMP2、MMP3、MMP9、CXCR4和E-cadherin的表达均明显下调（P＜0.05）；最后，Westernblot检测人肺癌95D细胞中相关信号通路变化结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7转染组相比，p-opt2Tcor-miR-7转染组中磷酸化Akt、磷酸化Erk和NDUFA-4蛋白的表达均显著下调，且具有统计学差异（P＜0.05）。 第二部分： 1.动态监测并记录人肺癌95D裸鼠荷瘤模型的肿瘤生长情况，绘制皮下肿瘤生长曲线并计算肿瘤抑制率，结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7实验组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组荷瘤小鼠的肿瘤生长速度明显减缓，肿瘤抑制率显著升高（P＜0.05）。 2.HE染色结果显示：p-Cont对照组肿瘤细胞形态不一，p-opt2Tcor-miR-7实验组可见大片肿瘤坏死区域；Real-timePCR检测结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7实验组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组中miR-7的表达水平显著升高（P＜0.05），同时p-opt2Tcor-miR-7实验组中细胞生长周期蛋白依赖性激酶CDK1、CDK2、CDK4和CDK6以及转移相关分子MMP2、MMP3、MMP9、CXCR4和E-cadherin的表达均显著下调，具有统计学差异（P＜0.05）；免疫荧光共聚焦结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7实验组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组中肿瘤增殖核抗原Ki67的表达水平明显降低（P＜0.05）；TUNEL法检测结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7实验组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组中局部细胞凋亡明显增加；Westernblot结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7实验组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组中磷酸化Akt、磷酸化Erk和NDUFA-4蛋白的表达均明显下降（P＜0.05），与前述体外实验结果一致；免疫荧光共聚焦结果显示：与p-Cont对照组和p-Tcor-miR-7实验组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组中NDUFA-4的表达水平明显降低（P＜0.05）；对p-opt2Tcor-miR-7重组载体在体内的分布和miR-7表达检测结果显示：尽管p-opt2Tcor-miR-7载体在小鼠主要脏器，包括心脏、肝脏等中均有分布，其中肺脏和肿瘤组织中质粒拷贝数最高，这与本课题组前期数据相似，重要的是与p-Cont对照组相比，p-opt2Tcor-miR-7实验组中除了肺脏和心脏以外，其他主要脏器中其miR-7的表达变化不显著，提示p-opt2Tcor-miR-7重组载体具有较好的靶向性。同时，荷瘤小鼠包括心脏、肝脏等主要脏器的形态学、重量、脏器指数及病理生理学均无明显差异（P＞0.05），且血清中血糖、血脂相关生化指标TC、TG、GLU、AST和ALT之间均无明显差异（P＞0.05），初步提示p-opt2Tcor-miR-7重组载体体内干预治疗具有较好的安全性。 结论： 第一部分：优化的TTF-1启动子核心序列可有效地调控miR-7的表达并抑制人肺癌细胞的体外生长； 第二部分：TTF-1opt启动子调控miR-7表达可显著抑制人肺癌细胞的体内生长。
NETL