摘要
本论文拟通过对来源于博伊丁假丝酵母（Candidaboidinii）的木糖还原酶（AR）基因和来源于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis168）的葡萄糖脱氢酶（GDH）基因进行共表达，来实现辅酶NADPH循环再生，以期提高重组大肠杆菌全细胞催化合成木糖醇催化效率。主要研究内容和结果如下： （1）以pET28a(+)表达载体，分别将木糖还原酶（AR）基因和葡萄糖脱氢酶（GDH）基因克隆至pET28a(+)中得到重组表达载体pET28a(+)-AR和pET28a(+)-GDH；随即将pET28a(+)-GDH中T7启动子和葡萄糖脱氢酶（GDH）基因共同克隆到pET28a(+)-AR中，得到携带双T7启动子的双基因表达载体pET28a(+)-AR-GDH。重组质粒经过酶切和测序验证，结果显示酶切产物片段大小均与其对应的理论值相符，木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因均未发生突变。 （2）将重组表达载分别化转至E.coliBL21（DE3）中，添加IPTG诱导重组蛋白表达，并提取粗酶液进行酶蛋白分子检测、酶活测定和相关酶学特性研究。结果显示，AR分子量约为39KDa，酶活为3.2U/mL，最适温度为25℃，最适pH为7，在30℃下保存半衰期为37.2h；GDH分子量约为39KDa，酶活为1.3U/mL，最适温度为40℃，最适pH为8，在40℃保存半衰期为12.5h。 （3）以E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-AR-GDH为全细胞催化剂，对酶的诱导表达条件及全细胞催化合成木糖醇的条件进行优化。结果显示最佳诱导条件：诱导时大肠杆菌生物量OD600为0.6，IPTG添加浓度0.6mM，诱导温度27℃，诱导时间12h，经诱导条件优化后，木糖醇产量较优化前提高了17.4%，达到15.3g/L，转化率为76.7%；最佳全细胞催化条件：催化温度35℃，细胞湿重0.08g/mL，细胞通透剂TritonX-100浓度为0.4%（v/v），转速150r/min。经全细胞催化条件优化后木糖醇产量较优化前提高了21.6%，达到18.6g/L，转化率为93.2%。 （4）得出最佳诱导条件和全细胞催化条件后，将木糖浓度提高到50g/L和100g/L，以考察重组菌株合成木糖醇潜能。结果显示，木糖浓度为50g/L时，木糖醇产量达到46.2g/L，转化率为91.4%；木糖浓度为100g/L时，木糖醇产量达到77.8g/L，转化率为78.2%。
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