摘要
抗体药物以其高特异性和高安全性的优势，在恶性肿瘤和自身免疫疾病等临床治疗中有着广泛的应用，是全球最热门的药物研发领域。抗体药物的生产主要涉及细胞培养、分离纯化和制剂三个主生产单元，过程复杂，影响因素繁多。质量源于设计(QualitybyDesign，QbD)旨在基于科学和质量风险管理，为预定质量的产品设计其生产过程，持续一致地生产符合预期质量的最终产品，是被美国食品药品监督管理局(FDA)推荐的质量设计理念。然而，该理念在抗体药物开发中的应用仍处于初级阶段，其中多数案例都是在细胞培养工艺开发阶段应用到了QbD理念，而无血清培养基的开发因成分繁多、过程复杂，QbD的应用甚少。如何应用QbD理念对复杂、多样的培养基成分进行统计分析、优化和控制是一个很大的难题和挑战。为此，本文针对CHO细胞培养这个生产单元，尝试应用QbD理念建立能分析、预测培养基关键组分的算法模型，应用于以抗体关键质量属性为导向的无血清培养基开发，并结合统计学工具和风险等级划分，建立基于抗体质量属性的CHO细胞无血清培养工艺设计和优化方法。 首先，本文对影响人源化抗体ACTE802关键工艺属性和关键质量属性的无血清培养基进行考察。通过单纯形格子(SimplexLattice)设计33组不同配方的无血清培养基，在细胞培养摇管中进行流加培养。培养结果显示，活细胞密度峰值最高为10.4×106cells/ml，活细胞密度对时间的积分(IVCC)最高为62.37×109cells.day/L，抗体产量最高为3.98g/L;抗体质量检测结果显示，电荷异构体主峰含量为57.24％-73.52％，酸性电荷异构体含量为21.96％-27.64％，碱性电荷异构体含量为1.79％-16.46％，低分子量片段比例为2.50％-6.28％，G0F糖型范围为74.4％-92％，Man5糖型范围为0.1％-1.0％。在此基础上运用局部加权回归算法（LOESS算法）对培养基组分重要性进行统计学分析，预测影响抗体产量和关键质量属性的关键组分总共有16个。确定性筛选设计(DSD)实验验证结果表明，共有13个关键组分确实对抗体产量及电荷异构体、低分子量片段、糖基化修饰产生了显著影响，LOESS预测的准确率超过80％。进而使用高斯混合模型(GMM)结合梯度提升决策树(GBDT)的混合模型GMM-GBDT建立抗体产量/抗体关键质量属性预测模型，一方面结合不确定性分析方法生成了3组新配方，并通过2L生物反应器规模的培养实验对这3组新配方进行对比分析，结果显示BMpro2配方的表现最优，抗体产量可达到4.16g/L，较混料筛选实验中综合表现最好的一组提高了21％，酸性异构体含量从27.29％降低至18.09％，低分子量片段比例从8.41％降低到了3.31％，其余质量属性均满足预设标准;另一方面，结合模型无关的局部可解释性方法（LIME算法），考察关键培养基组分有效添加浓度的波动对关键工艺属性和关键质量属性的影响，预测了关键培养基组分有效添加浓度在理论浓度±5％的范围内波动时的抗体产量和关键质量属性的变化范围，并对其进行了单因素实验验证，实验结果证明了这些关键组分浓度在±5％范围内波动时，抗体产量和关键质量属性均在对照组检测结果的±10％区间内，没有引起很大的波动。由此可见，在QbD理念基础上建立的算法模型，能分析、预测培养基关键组分对抗体关键质量属性的影响，由此开发的无血清培养基具有优异的工艺表现和稳健性，降低了培养基组分在设计空间波动时可能引起的关键工艺属性和关键质量属性的失效风险。 在上述开发的无血清培养基基础上，通过鱼骨图和因果矩阵分析，发现接种密度、培养温度、pH、流加策略和培养周期等相关参数对流加培养过程的工艺表现存在较高风险，为此将这些参数定义为潜在的关键工艺参数。经部分析因设计实验证实，培养温度、接种密度和流加策略对工艺属性和关键质量属性的影响显著(P＜0.05)，被认定为ACTE802细胞培养工艺开发、优化和运行的关键工艺参数。由此通过响应面中心复合实验设计，对接种密度、培养温度和流加策略进行了设计空间的探索，明确了关键工艺参数培养温度、接种密度和流加策略的设计空间分别为36.5-37.5℃、1.0-1.8×106cells/ml和26％-34％。进而在2L生物反应器规模上共完成了15批次培养实验，抗体产量达到4.10±0.44g/L，酸性电荷异构体含量为16.15±1.39％，碱性电荷异构体含量为7.63±2.75％，聚体比例为1.14％±0.28％，低分子量片段比例为3.36±1.02％，G0F糖型范围为77.00±5.64％，Man5糖型范围为0.70±0.19％，均落在产品关键质量属性的设计范围之内，证明上述开发的工艺具有令人满意的稳健性。 最后，将以上确定的无血清培养基和细胞培养工艺放大到200L生物反应器中试规模，采用等功率（P/V相等）放大原则实施过程的放大，成功完成了6批200L规模反应器的培养实验，200L反应器产量均值为4.04g/L，聚体比例均值为1.12％，低分子量片段比例均值为4.15％，酸性电荷异构体含量均值为16.37％，碱性电荷异构体含量均值为5.73％，G0F糖型均值为80.96％，Man5糖型均值为0.82％，都在2L反应器相应数据的Mean±1.5SD范围内。采用15批2L反应器的过程数据、工艺属性和关键质量属性数据建立的偏最小二乘回归方法(PLS)模型和主成分分析(PCA)模型对6批200L反应器培养实验的工艺表现进行评估，PLS分析结果显示6批200L中试规模的细胞培养过程参数轨迹都落在2L培养过程参数轨迹的控制限以内(Average±3SD)，PCA分析结果显示200L反应器的批次点都分布在2L反应器数据的95％置信区间内，表明200L反应器工艺表现及产品质量与2L反应器一致，工艺具有很好的稳健性和可放大性，且满足预先设计的关键工艺属性和关键质量属性要求。 本文研究工作尝试了基于QbD理念进行抗体药物工艺开发的新思路和理解，针对细胞培养生产单元采用多种统计学方法能很好表征培养基组成和培养过程参数与关键工艺属性/关键质量属性的关系，实现了从摇管到中试规模细胞培养工艺过程的快速建立，降低了细胞培养生产单元失效的风险，进而为高效、可控地工业化生产ACTE802抗体奠定了坚实的基础，目前该项目已成功进入Ⅱ期临床试验。此外，也为其它抗体药物细胞培养工艺的开发和建立提供了重要的指导意义。
NETL