摘要
病原菌通过多种手段入侵宿主，引起组织损伤，逃避宿主免疫防御和杀伤，达到感染和致病的目的。许多病原菌能够直接注射细菌蛋白即效应物来干扰宿主细胞正常生理功能，促进感染。鉴定病原菌效应物和解析它们的功能是理解病原菌致病机制的关键。杀鱼爱德华氏菌是一种重要的胞内寄生菌。对杀鱼爱德华氏菌的毒力因子研究证明三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS)是其重要的毒力系统，但是对杀鱼爱德华氏菌效应物还知之甚少。 前期工作中，我们建立了一个杀鱼爱德华氏菌感染巨噬细胞模型，发现一部分胞内增殖的细菌在感染后期能够通过caspase-1依赖的细胞焦亡逃逸到上清中，并表现出一个T3SS/T6SS响应的转录谱。从该转录谱，我们挑选出受调控最明显的前200个基因作为效应物筛选文库，结合TEM1-β-内酰胺酶报告系统鉴定了它们的胞内转运。结果发现25个候选蛋白胞内转运呈阳性，是可能的杀鱼爱德华氏菌效应物，其中包括五个已鉴定的效应物:EseG、EseJ、EseH、EseK和EvpP。进一步对25个候选效应物的分泌分析发现，它们的分泌途径各不相同，有8个候选效应物的分泌既不依赖T3SS也不依赖T6SS，说明杀鱼爱德华氏菌存在T3SS和T6SS之外的效应物转运方式。另外，我们鉴定到两个新的T6SS效应物EseL和EseM，分别由基因ETAE_1303和ETAE_2136编码，还鉴定到三个新的外膜小泡OMV依赖的效应物EseN、EseO和EseP，分别由基因ETAE_0247、ETAE_0490和ETAE_2080编码。考察新鉴定的五个效应物对杀鱼爱德华氏菌在斑马鱼上的毒力影响发现，它们共同作用促进杀鱼爱德华氏菌的毒力。 杀鱼爱德华氏菌作为一个胞内寄生菌，它在宿主细胞内的存活和复制对其毒力至关重要。已有研究发现，杀鱼爱德华氏菌能够入侵多种宿主细胞并在细胞内存活和复制，但是它们在宿主细胞内的存活机制还不清楚。我们对杀鱼爱德华氏菌感染非吞噬细胞的感染过程进行研究，发现其主要依赖T3SS存活在宿主细胞中。在内化到宿主细胞后，杀鱼爱德华氏菌在小泡中存活，在短暂的与早期内吞体相互作用之后，利用其T3SS抑制吞噬体的成熟，使之不能被溶酶体降解。对这种特殊的含菌囊泡ECV进行观察发现，它具有内质网的特征，包含有内质网蛋白Calnexin。同时，我们发现T3SS效应物EseJ是参与杀鱼爱德华氏菌胞内复制的一个重要效应物，主要通过抑制内吞体与溶酶体的融合而抑制溶酶体对细菌的清除作用。在小鼠和斑马鱼上的活体实验均证明，EseJ能够促进杀鱼爱德华氏菌的体内存活和感染。 天然免疫系统是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线。炎症小体是由胞内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。越来越多的研究表明，炎症小体的激活在宿主抵抗病原微生物感染的过程中发挥着重要作用。NLRP3炎症小体是目前研究广泛但机制仍不清楚的一种炎症小体。我们对NLRP3炎症小体的形成机制进行了研究，发现Rack1是参与NLRP3激活的一个重要调控蛋白。敲除Rack1，抑制了NLRP3炎症小体的激活，但不影响NLRC4和AIM2炎症小体的激活。通过与NLRP3结合，Rack1响应钾离子信号，影响ASC寡聚化，从而影响NLRP3的激活。小鼠实验也证明，Rack1参与NLRP3炎症小体的激活。
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