摘要
猪链球菌2型（Streptococcussuisserotype2,SS2）是一种重要的人畜共患病原菌，其感染宿主可导致脑膜炎，治愈后常伴有不可逆转的后遗症。烯醇化酶（Enolase,ENO）是SS2重要的毒力因子。团队前期研究发现ENO通过与猪脑微血管内皮细胞（Porcinebrainmicrovascularendothelialcells,PBMECs）的核糖体蛋白SA（RibosomalproteinSA,RPSA）互作，促进PBMECs的凋亡，抑制紧密连接蛋白（Tightjunctionprotein,TJs）的表达，从而破坏血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）。RPSA是核糖体蛋白之一，主要在细胞胞内参与蛋白合成。近年来，研究发现RPSA在细胞膜异常分布并介导病原入侵宿主细胞。 质膜表面RPSA主要定位于“脂筏”，其中向内凹陷的“脂筏”又称为“小窝”。“小窝”介导的内吞作用是病原体侵入宿主细胞的主要途径之一，“小窝”对于免疫细胞的内吞作用和病原菌的清除也同样重要。但是，关于RPSA向细胞膜转移并在细胞膜参与致病的机制尚不清楚。因此，揭示RPSA在细胞膜定位、相互作用分子以及“小窝”在RPSA介导SS2感染宿主细胞过程中的作用十分必要。本研究以RPSA为研究对象，围绕其介导ENO刺激人脑微血管内皮细胞（Humancerebralmicrovascularendothelialcells,HCMECs）中的作用展开了几下研究： 1.生物信息学方法分析RPSA在SS2脑膜炎发病中的功能及信号途径 为探究RPSA在SS2感染宿主后可能发挥的作用，首先我们利用本课题组已有的脑脊液和血清蛋白组学数据库（SS2脑膜炎感染模型的仔猪和健康仔猪），借助生物信息学手段分别筛选了脑脊液和血清中的差异表达蛋白（Differentiallyexpressedprotein,DEPs），并对其涉及的信号通路进行分析。结果发现SS2感染显著引起了仔猪的能量代谢、胆固醇代谢和胞吐作用等生物途径的应答。结合蛋白互作数据库和蛋白共表达数据库，我们进一步证明了波形蛋白（Vimentin,VIM）等DEPs与RPSA密切相关，这些DEPs除了参与神经性疾病过程，还显著富集在核糖体、能量代谢、细胞坏死和NOD样受体等生物途径。 2.SS2刺激下RPSA在HCMECs中的定位 蛋白不同的亚细胞定位往往发挥不同的功能。我们采用免疫印迹（westernblot,WB）和免疫荧光等方法研究SS2感染HCMECs过程中，RPSA的亚细胞定位以及质膜RPSA和“小窝”的定位关系。结果发现，SS2感染促进RPSA蛋白表达水平的显著升高，而且引起了细胞内“空泡化”增多。同时，SS2感染促进了RPSA从胞内向胞膜转移。生理条件下，RPSA和小窝蛋白-1（Caveolin1,CAV1）在质膜表面部分共定位。然而，SS2感染会促进质膜表面CAV1发生聚集，RPSA向质膜外形成凸起，最终形成RPSA包裹CAV1的膜表面结构。使用甲基-β-环糊精（Methyl-beta-cyclodextrin,MβCD）消耗细胞膜的胆固醇以破坏“小窝”的功能和/或结构后，消除了RPSA和CAV1定位的动态变化。首次阐明了SS2感染HCMECs过程中，RPSA的亚细胞定位变化，并且证明了“小窝”参与到RPSA介导的SS2感染HCMECs过程。 3.RPSA-VIM-CAV1形成膜复合体参与SS2感染HCMECs 结合生物信息学分析获得的RPSA可能的互作分子，通过Pull-down、质谱测序、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）以及多色荧光免疫组化等实验研究质膜RPSA在SS2感染HCMECs中的膜复合体组成和相互关系。结果发现，RPSA、CAV1、VIM以及连接桥粒斑珠蛋白（JunctionPlakoglobin,JUP）等分子在质膜共定位，并且彼此间相互作用形成复合物。体外添加ENO重组蛋白刺激细胞后，RPSA、CAV1和VIM间的互作增强。然而，RPSA与JUP间的相互作用减弱。这些结果进一步细化了RPSA在质膜表面的定位，表明质膜RPSA定位于桥粒/中间丝网络。并且，细胞膜表面RPSA、CAV1、VIM以及JUP等分子以复合体的形式存在。 4.RPSA-VIM-CAV1复合体在SS2感染HCMECs中的作用机制 由于ENO刺激促进了RPSA-CAV1-VIM彼此间的相互作用，本研究通过免疫荧光、RNA干扰、流式细胞术和WB等方法进一步揭示RPSA、VIM和“小窝”在ENO抑制TJs表达和诱导细胞凋亡过程中的作用。结果发现，RPSA可以促进VIM蛋白表达。ENO刺激RPSA促进VIM的蛋白水平升高，进而抑制了紧密连接蛋白ZO-1，促进了促凋亡分子Smac的蛋白水平。 另外本研究显示，“小窝”结构和功能正常时，膜表面的CAV1围绕ENO分布，使ENO定位于细胞的溶酶体。然而，当用MβCD破坏“小窝”功能和/或结构，CAV1在膜表面呈聚集状，导致ENO的内吞受阻，不能进入溶酶体降解；ENO在膜表面粘附、聚集增强，RPSA和VIM的蛋白水平显著升高，增强对紧密连接蛋白ZO-1的表达抑制、促进Smac蛋白水平显著升高，诱导细胞死亡加重。回补胆固醇减弱MβCD对“小窝”功能和/或结构的损伤，可以适度逆转这些影响，表明“小窝”通过内吞作用减弱了RPSA-VIM介导的ENO对HCMECs的毒性作用。 综上，我们首次阐明了SS2感染过程中，ENO、RPSA、VIM和“小窝”间的作用关系和诱导细胞凋亡破坏BBB的机制，为SS2脑膜炎疾病的防治提供了理论基础。
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