摘要
围产期期间大部分奶牛（尤其是高产奶牛）由于泌乳等所需的能量消耗急剧增加以及干物质采食量的降低，导致机体进入能量负平衡（NEB）状态。长时间的NEB导致机体动员脂肪释放大量的游离脂肪酸（FFA）进入血液。肝脏摄入的FFA也随之增加，部分FFA发生不完全氧化，生成酮体（β羟丁酸（BHB）、乙酰乙酸（AA）和丙酮）。高浓度的FFA和BHB具有脂毒性，导致肝脏脂代谢紊乱的同时发生氧化应激、细胞凋亡等病理损伤。此外，奶牛发生酮病时表现高FFA血症及肝损伤，但高FFA如何引发肝损伤尚不清楚。自噬是一种通过溶酶体依赖性机制捕获并降解机体不需要的蛋白质、大分子复合物和细胞器的过程。研究发现诱导自噬可以缓解非酒精性脂肪肝小鼠的肝损伤，而抑制自噬则加重肝损伤及脂蓄积。此外，研究报道患有重度脂肪肝奶牛的肝脏自噬活性受损且与肝脏的炎性反应及肝功能受损有关，但尚未明确酮病奶牛肝组织细胞自噬状态与肝功能的关系。因此，本试验的目的是探究自噬在酮病奶牛肝损伤发生过程中的作用及调节机制。 本研究收集临床酮病奶牛和健康奶牛血液和肝脏样本，检测酮病奶牛肝损伤及肝脏炎性反应状态。结果表明，临床酮病奶牛血清天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的活性高于健康奶牛，说明临床酮病奶牛肝脏存在肝损伤。临床酮病奶牛血清促炎因子白介素（IL）18、IL1B和肿瘤坏死因子（TNF）-α的水平显著高于健康奶牛，而抗炎因子IL10的含量低于健康奶牛，说明临床酮病奶牛存在系统性炎性反应。临床酮病奶牛肝脏核转录因子（NF-κB）信号通路关键分子NF-κB和IκBα的蛋白磷酸化水平、肝组织TNFA、一氧化氮合酶2（NOS2）、单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的mRNA表达均高于健康奶牛，而抗炎基因IL10的mRNA表达低于健康奶牛，说明临床酮病奶牛肝组织NF-κB信号通路过度激活。此外，临床酮病奶牛肝脏NOD样受体蛋白（NLRP）3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1，CASP1）的蛋白和mRNA的表达以及CASP1活性显著高于健康奶牛，说明临床酮病奶牛肝组织NLRP3炎性小体过度激活。 本研究收集亚临床酮病奶牛（SCK）、临床酮病奶牛（CK）和健康奶牛的血液和肝脏样本，检测肝组织细胞氧化应激、自噬和线粒体自噬状态。结果表明，SCK和CK奶牛肝组织的氧化应激标志物丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的水平高于健康奶牛，说明SCK和CK奶牛肝脏存在氧化应激，且CK奶牛肝脏氧化应激更加严重。与CK和健康奶牛相比，SCK奶牛肝组织的微管相关蛋白1轻链3（MAP1LC3，又称LC3）、泛素结合蛋白（SQSTM1，又称p62）、自噬相关蛋白（ATG）5、ATG7、ATG12和磷酸化磷脂酰肌醇激酶3催化亚单位3（PIK3C3）的mRNA表达上调。与健康牛相比，SCK奶牛肝组织p62蛋白表达降低，LC3-II的表达升高，说明SCK奶牛肝组织细胞自噬体的生成和降解都得到了增强。相反，CK奶牛肝组织的p62和LC3-II的蛋白表达高于健康奶牛，而SQSTM1和MAP1LC3基因表达低于健康奶牛，自噬体生成相关基因ATG7和ATG12的mRNA表达低于健康奶牛，说明CK奶牛肝组织细胞自噬体的生成和降解都受损。此外，SCK奶牛肝组织PTEN介导的假定激酶蛋白（PINK）1和Parkin的蛋白表达高于健康奶牛，而CK奶牛肝组织PINK1和Parkin的蛋白表达略微降低，说明SCK奶牛肝组织细胞线粒体自噬活性增强，而CK奶牛肝组织细胞线粒体自噬活性受损。 接下来，本实验检测不同浓度FFA（0、0.3、0.6和1.2mM）、自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin）和自噬抑制剂氯喹（CQ）对奶牛原代肝细胞自噬、氧化应激、NF-κB信号通路和NLRP3炎性小体的影响。结果表明，0.6和1.2mMFFA处理组中NF-κB的磷酸化、NLRP3和CASP1的蛋白表达、CASP1活性及IL18和IL1B的mRNA的表达显著升高，说明0.6和1.2mMFFA激活肝细胞NF-κB信号通路及NLRP3炎性小体。0.6和1.2mMFFA处理组肝细胞MDA和H2O2的含量高于对照组，说明0.6和1.2mMFFA引起肝细胞的氧化应激。此外，自噬标志物LC3-II和p62的蛋白表达在0.6和1.2mMFFA处理组中显著升高，说明高FFA处理阻断了肝细胞自噬。自噬抑制剂CQ预处理后再添加1.2mMFFA，加剧了高FFA引起的肝细胞氧化应激及NF-κB炎性信号通路和NLRP3炎性小体的激活。相反，使用自噬激活剂rapamycin缓解了高FFA引起的肝细胞氧化应激和炎性反应。上述结果说明高FFA阻断奶牛肝细胞自噬引发氧化应激和炎性通路过度激活。诱导自噬缓解FFA引起肝细胞的氧化应激和炎性信号通路的激活。 综上，本研究表明高FFA阻断酮病奶牛肝组织细胞自噬，引发氧化应激并激活炎性信号通路，进而导致肝损伤。这些结果部分阐明了奶牛酮病的发病机制，为通过调节自噬防治酮病奶牛肝损伤奠定理论基础。
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