摘要
副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是细菌性食源性疾病的主要致病菌之一，常引发食物中毒。近年来，由于抗生素滥用导致的多重耐药副溶血性弧菌的出现严重危及人体健康。因此，亟需有效的杀菌剂对其进行治疗与防控。铁死亡是一种具有铁离子依赖性的新型细胞死亡方式，通过激活或抑制铁死亡可以干预癌症等疾病的发展。为此，本文选用低价高利用率的铁营养强化剂——硫酸亚铁，探究其对副溶血性弧菌的杀菌作用以及潜在的作用靶标，同时进行了三文鱼保鲜的应用研究。主要研究结果如下： 1.硫酸亚铁对副溶血性弧菌具有杀菌作用 通过滴板试验和平板计数法，探究硫酸亚铁对副溶血性弧菌的浓度效应和时间效应，结果显示8μM硫酸亚铁处理0.5h可以清除约99%的副溶血性弧菌，表明副溶血性弧菌对硫酸亚铁具有高度的敏感性；扫描电子显微镜结果显示硫酸亚铁处理能够导致副溶血性弧菌膜系统受损严重，通过PI荧光染料荧光标记与分析，进一步发现硫酸亚铁处理可导致副溶血性弧菌的细胞膜损伤和铁死亡。 2.影响硫酸亚铁对副溶血性弧菌杀菌作用的主要因素 前期试验发现，亚铁离子易与许多物质发生络合反应，为了确保亚铁离子杀菌的稳定性，本章通过平板计数法和滴板法研究了影响硫酸亚铁对副溶血性弧菌杀菌效果的主要因素，结果表明：外源添加浓度低于1mM的金属离子（Al3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+）、维生素（维生素C和维生素E）、氨基酸（L-半胱氨酸和谷胱甘肽）以及糖类（葡萄糖、蔗糖）可促进硫酸亚铁的杀菌作用，而外源添加浓度高于10μM的金属离子（K+、Mg2+和Ca2+）、磷酸盐（磷酸二氢钾和磷酸二氢钠）、金属螯合剂（EDTA和DTPA）、氨基酸（甘氨酸和谷氨酸）和浓度高于10μg/ml的蛋白质（牛血清蛋白和酪蛋白），会钝化硫酸亚铁对副溶血性弧菌的杀菌作用。由此说明金属离子、维生素、磷酸盐、金属螯合剂、氨基酸、糖类、蛋白质类和核酸类均会影响硫酸亚铁对副溶血性弧菌的杀菌效果，在试验过程中应及时避免这些因素的干扰。 3.硫酸亚铁处理下副溶血性弧菌的转录组测序分析 为进一步了解硫酸亚铁作用于副溶血性弧菌的分子途径，将经硫酸亚铁处理后的副溶血性弧菌和野生型菌株样本进行转录组测序。分析结果表明，经硫酸亚铁处理后的副溶血性弧菌差异表达基因数量最多的是细胞蛋白质代谢途径，其中RseB表达上调，外膜蛋白OmpA、OmpK、OmpV和OmpW表达下调，RseB是转录起始因子的负调控因子，为此推测硫酸亚铁很可能作用于RseB，进而抑制了副溶血弧菌膜蛋白的正常装配，导致相关膜蛋白的转录受阻，最终引起副溶血性弧菌死亡。接着利用生物信息学技术对RseB蛋白进行同源建模，通过Autodock软件进行Fe2+分子与RseB蛋白对接，发现Fe2+可能与RseB第5位亮氨酸、第13位丝氨酸、第16位丝氨酸和第147位脯氨酸产生相互作用，进一步表明RseB可能是介导硫酸亚铁作用于副溶血性弧菌的潜在靶标。 4.硫酸亚铁可应用于三文鱼的保鲜 前期试验结果表明硫酸亚铁对体外的副溶血性弧菌具有很好的杀菌作用，那么对于受到副溶血性弧菌感染的鱼肉是否具有同样的杀菌效果尚不明确。为此通过喷淋的方式将硫酸亚铁应用于三文鱼的保鲜，结果表明：经不同浓度的硫酸亚铁处理后对三文鱼片的感官品质、pH值、剪切力、弹性和硫代巴比妥酸值影响差异均不显著；且随着硫酸亚铁使用浓度的增加，三文鱼片的保鲜效果越佳，其中使用500μM的硫酸亚铁处理30min，副溶血性弧菌的杀菌率高达99%，说明硫酸亚铁有防控三文鱼中副溶血性弧菌污染的潜力，同时对于消费者而言，硫酸亚铁有望作为杀菌剂避免副溶血性弧菌的感染，同时作为补铁剂补充人体内的铁微量元素。 综上所述，研究结果表明：硫酸亚铁对副溶血性弧菌具有良好的杀菌作用，基于转录组测序和生物信息学技术，本文预测了硫酸亚铁在副溶血性弧菌中的潜在靶标为RseB，可为之后深入探究副溶血性弧菌具体的铁死亡机制提供重要的理论基础。同时硫酸亚铁可以实现在三文鱼中的保鲜应用，也为新型杀菌剂的研发提供一定的参考。
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