摘要
角鲨烯(Squalene)作为一种重要的萜类化合物，具有降血脂、防癌和抗氧化等功效，因此广泛应用于医疗保健领域。由于自然资源的限制和化学合成的困难，利用微生物发酵生产角鲨烯已经成为主要趋势。海洋微藻裂殖壶菌（Schizochytriumsp.）中角鲨烯合成与油脂合成竞争前体、与细胞生长耦合，是具有高产角鲨烯潜力的优良菌株。但目前关于裂殖壶菌生产角鲨烯的研究主要停留于培养条件的优化阶段，代谢途径调控研究报道较少。 本研究以裂殖壶菌SchizochytriumlimacinumSR21为野生型菌株，利用代谢工程策略来平衡脂质合成与角鲨烯合成的碳代谢通量，运用组学技术分析相关基因在角鲨烯合成中的作用以及细胞内代谢物水平的变化，最后通过发酵参数优化提高角鲨烯产量。主要研究内容和结果如下: (1)脂质合成途径调控:延长酶基因elo1敲除菌株生物量和油脂含量分别降低了17.78％和29.35％，角鲨烯产量相比于野生型提高35.53％，达到9.65mg/L;elo1基因敲除引导乙酰辅酶A的重新分配，为角鲨烯合成提供了更多的前体;同时，elo1基因敲除抑制了不饱和脂肪酸的合成，使得羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的酶活提高，促进了甲羟戊酸途径的代谢。甘油三酯合成途径中磷脂酸磷酸酶基因pap的敲除严重影响了裂殖壶菌细胞生长和油脂合成，生物量和油脂量分别下降了34.8％和58.2％，角鲨烯产量相比于野生型(7.12mg/L)增加了37.08％，最大产量为9.76mg/L;Pap基因敲除一方面间接抑制了脂肪酸合成途径，增强了甲羟戊酸途径通量，另一方面促进了脂肪酸的β-氧化，增强了乙酰辅酶A的供应，同时刺激细胞合成更多的角鲨烯来抵抗脂肪酸氧化产生的氧化压力(ROS)。 为了降低基因pap敲除对细胞生长的不利影响，本研究将elo1基因敲除结合pap基因干扰获得突变株MIX:与野生型菌株相比，MIX菌株生物量和油脂量分别降低了13.96％和18.50％，角鲨烯产量提高了41.43％，达到10.07mg/L。组合调控中的pap基因干扰使得3-磷酸甘油醛更多地流向丙酮酸合成，促进了乙酰辅酶A的供应;同时elo1基因的敲除引导乙酰辅酶A重新分配，一方面流向TCA循环的通量增强为细胞生长以及产物合成提供充足的能量和还原力，另一方面流向甲羟戊酸途径的通量增强促进了角鲨烯的合成。MIX菌株充分发挥了基因改造对碳代谢平衡的调控作用，促进了角鲨烯的积累。 (2)甲羟戊酸途径调控:角烯合成酶基因sqs过表达菌株生长缓慢，并且生物量和油脂含量分别降低了28.1％和43.7％，角鲨烯最大产量相比于野生型菌株提高78.5％，达到12.78mg/L。本研究发现发酵后期羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因hmgr转录水平的降低可能是导致角鲨烯无法持续积累的重要原因。本研究进一步过表达hmgr和sqs基因得到HS菌株，该菌株生物量提高了13.63％，角鲨烯产量提高了88.82％，达到13.45mg/L。sqs基因和hmgr基因的共表达显著提高了甲羟戊酸途径的碳代谢通量，促进了角鲨烯的合成与积累。 (3)脂质代谢和甲羟戊酸途径组合调控:为了最大限度提高角鲨烯合成的碳代谢通量，本研究组合调控脂质代谢和甲羟戊酸途径得到HSM菌株，但是该菌株代谢负担明显加重，细胞膜成份和功能受到严重影响，生物量和角鲨烯的产量远低于野生型菌株和其他基因工程菌株。 (4)发酵调控优化:裂殖壶菌角鲨烯的积累与细胞生长耦合，提高生长速率并延长对数生长期有利于角鲨烯的合成与积累。经优化，裂殖壶菌生产角鲨烯的最佳培养基为:葡萄糖60g/L，蛋白胨20g/L，C/N10.87，玉米浆粉10g/L，硫酸镁和氯化钙1g/L，氯化钠6g/L，无机盐组分50mL/L。在此培养条件下，HS菌株的角鲨烯产量为26.97mg/L，为基础培养基条件下(13.45mg/L)的2.01倍。 本研究通过对脂肪酸合成途径、甘油三酯合成途径以及甲羟戊酸途径的关键基因的调控，平衡了脂质代谢和角鲨烯合成之间的碳代谢通量，促进了裂殖壶菌角鲨烯的合成与积累;并利用发酵工艺优化刺激碳通量流向角鲨烯的合成，激发裂殖壶菌生产角鲨烯的能力。本研究为裂殖壶菌角鲨烯的生产提供了理论支持，也为裂殖壶菌中萜类化合物的合成奠定了基础。
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