摘要
核苷酸，一类由含氮碱基、五元糖环和磷酸基团组成的重要的生物分子。除了是DNA和RNA的合成底物外，核苷酸还参与细胞信号转导、辅酶调节和代谢等重要的生理过程。很多抗癌药物是核苷酸类似物，其相关的磷酸化代谢产物在抑制肿瘤生长中起关键作用。因此，核苷酸含量的分析，可以为了解核苷酸与疾病之间的关系提供信息，并为疾病的治疗和诊断提供新的思路和策略。 目前，研究者已建立了一些检测核苷酸的方法，如毛细管电泳（Capillary electrophoresis,CE）、高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）等。然而，通常这些方法的检测灵敏度不高，并且鉴定核苷酸的定性能力较弱。目前，LC–MS也经常用于分析核苷酸，但核苷酸的极性较强，因此在反相色谱柱上的保留能力弱，不利于核苷酸的色谱分离。离子对试剂的使用，可以提高核苷酸在反相色谱柱上的保留。然而，这些添加剂会污染质谱仪，并抑制质谱分析过程中的分析物的离子化，导致分析物的检测灵敏度低。亲水相互作用色谱与质谱联用（Hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry,HILIC–MS）是检测核苷酸的另一种技术，但是经常出现色谱峰拖尾和峰漂移现象，不利于对核糖核苷酸的分离，使得方法的重现性差、检测灵敏度低。基于毛细管电泳结合质谱（CE–MS）的方法可以实现核苷酸的灵敏检测分析，但实验室通常需要制备毛细管或电极。 近年来，化学标记策略已得到很大关注，通过化学标记可以改善色谱质谱分析过程中对目标物的分析性能。化学标记策略可将带电的或易于质子化的部分引入目标化合物，在正离子检测模式下进行LC–MS分析时，可以有效提高目标化合物的检测灵敏度，并且可以改善目标分析物的色谱分离。课题组前期开发了分析甲基化核苷酸的化学标记策略，但是该反应条件比较剧烈，核苷酸通常不稳定，容易丢失磷酸基团，尤其是三磷酸核苷。因此，理想的核苷酸的化学标记反应，可以在温和的条件下进行，且能在相对短的时间内完成反应。对内源性化合物的准确定量分析，一般要依赖于相应的稳定同位素标准品，但是商品化的同位素核苷酸标准品很少，而且价格比较昂贵。因此，为了实现灵敏且准确地检测内源性核苷酸，稳定同位素的化学标记策略与LC–MS相结合用于分析核苷酸，是一个较好的策略。基于此，本课题开展了以下研究工作： （1）合成了一对轻重同位素重氮试剂，2-DMBA与d5-2-DMBA。在温和条件下，2-DMBA（d5-2-DMBA）可以有效且特异性地标记到核苷酸上的磷酸基团上。基于此标记反应，建立了一种重氮试剂标记策略结合质谱分析核苷酸的分析方法。将标记之后的核苷酸与未被标记的核苷酸进行比较，结果表明，重氮标记之后，核苷酸的检测灵敏度提高了17-174倍，且能够有效改善核苷酸在反相色谱上的保留能力和色谱分离度。利用所建立的分析方法，实现了少数（8个）细胞中12种内源性核苷酸的定性和定量分析；并且发现12种核糖核苷酸在乳腺癌组织和对应癌旁组织中含量具有显著性差异，为进一步探究癌症的发生发展与核苷酸代谢之间的联系提供有利的技术支撑。 （2）合成了一对轻重同位素异构体试剂，DMPI和d3-DMPI。DMPI和d3-DMPI带有活性较高的重氮基团，该重氮基团可与极性磷酸代谢物上的磷酸基团进行高效、特异性反应。基于此标记反应，建立了一种新型重氮试剂标记策略结合LC–MS的核苷酸的分析方法，对比未标记的核苷酸，重氮标记之后，核苷酸的灵敏度提高了25-1137倍。利用该方法，实现了单个哺乳动物细胞中以及单个拟南芥雄蕊中12种内源性核糖核苷酸的检测，并发现高温胁迫会引起雄蕊中内源性核糖核苷酸含量的显著降低。 综上所述，建立了化学标记结合LC–MS的核苷酸高灵敏度分析方法，实现了单个细胞中的核苷酸检测，该方法在分析一些珍贵样品中的核苷酸具有一定的优势，如循环肿瘤细胞，组织样本等。另外，建立的分析方法在在分析磷酸代谢物的方面，以及单细胞代谢组学方面具有较大的应用潜力。
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