摘要
高分子化合物是相对分子质量高达几千到几百万的化合物，根据其来源可以分为天然高分子和合成高分子两大类，已经广泛地应用于人们的衣、食、住、行，国民经济各部门和尖端技术中。蛋白质作为一种天然的高分子，除了在材料中的广泛应用外，目前还广泛地应用于医药药物的开发。了解蛋白的结构为蛋白质药物的开发提供了很好的研究基础。 艾克曼菌是位于宿主肠道粘液层中的益生菌，对宿主肠炎、肥胖和糖尿病等代谢疾病有明显改善或治疗作用。该菌的外膜蛋白Amuc_1100在该菌与宿主的相互作用过程中发挥了关键作用。Amuc_1100不仅可以减少小鼠脂肪含量、降低宿主胰岛素抵抗性和血脂异常功能，还可以激活Toll样受体2（TLR2）的NF-κB信号通路从而刺激IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α等细胞因子的产生调节宿主免疫应答，此外还可以通过激活TLR2信号增强宿主肠道屏障功能，但是其具体的分子机制尚不清楚。5-羟色胺（5-HT）不仅是一种神经递质，也是调节胃肠道和其他器官功能的关键信号分子，与多种生理病理过程相关。TLR2作为微生物识别受体，除了有助于维持肠道内稳态，改善炎症性肠道损伤外还可以通过调控5-HT限速合成酶Tph1和5-HT转运蛋白（serotonin transporter,SERT）的表达来调控肠道5-HT水平在肠道生理和病理中发挥作用，Amuc_1100是否可以通过激活TLR2从而调控肠道5-HT系统还不明确。 本文使用大肠杆菌异源表达系统获得了Amuc_1100的胞外结构域（氨基酸31-317），通过镍柱纯化和分子筛纯化获得了纯度高且均一性好的重组蛋白，使用X射线衍射技术解析了Amuc_1100的蛋白结构。Amuc_1100的整体结构是由4条反向平行的β折叠片和4个α螺旋组成，其中C端的2个α螺旋与4条反向平行的β折叠片形成了两个“αββ”基序，构成了Amuc_1100的核心结构域，该结构域与细菌Ⅳ型菌毛或者Ⅱ型分泌系统蛋白具有相似的折叠方式。N端呈卷曲螺旋（coiled-coil）折叠的α1螺旋展现出新的拓扑学结构。Amuc_1100在晶体中呈三聚体结构，但是在溶液中以单体的形式存在，对其结构进行分析发现N端的α1螺旋在蛋白的聚集状态中起重要作用。为了研究α1螺旋对蛋白聚集状态的影响，构建了α1螺旋缺失的突变体即Amuc_1100Δ80并在大肠杆菌中进行异源表达，在经过镍柱纯化和分子筛纯化获得纯度高且均一性好的蛋白后，利用X射线衍射技术解析了Amuc_1100Δ80的晶体结构，根据解析的结构可知Amuc_1100Δ80在晶体中为二聚体结构，与已报道的Ⅳ型菌毛或者Ⅱ型分泌系统蛋白的聚集方式相似，同样地在溶液中Amuc_1100Δ80的状态也为二聚体，这些结果表明Amuc_1100的α1螺旋在Amuc_1100聚集状态中起重要作用。虽然Amuc_1100可以激活TLR2，但是具体作用机制并不明确。本文利用生物膜干涉技术以及酶联免疫吸附测定实验明确了Amuc_1100是TLR2的一种新的配体，可以直接与TLR2发生相互作用。而且Amuc_1100Δ80与TLR2具有更高的结合亲和力，暗示着Amuc_1100Δ80可能是开发A.muciniphila相关蛋白质高分子药物更加有利候选基因。 明确Amuc_1100与TLR2之间的直接相互作用后，本文在细胞水平证明了Amuc_1100能通过与TLR2直接相互作用提高RIN-14B细胞中Tph1的表达，降低Caco-2细胞中SERT的表达，从而促进5-HT的生物合成，提高5-HT的细胞外含量。动物学水平上以抗生素处理小鼠为动物模型，给小鼠灌胃A.muciniphila或者Amuc_1100后，小鼠结肠组织的Tph1表达提高，SERT表达降低，结肠和血液的5-HT水平明显提高。肠道内5-HT的变化会影响肠道蠕动功能，本文同时检测了Amuc_1100和A.muciniphila对抗生素处理小鼠肠道蠕动的影响并且发现两者在提高抗生素小鼠肠道5-HT生成后同时改善了小鼠肠道蠕动功能。肠道中5-HT水平的变化不仅直接影响肠道生理功能，也对肠道微生物组成和丰度产生影响，进而影响宿主的多种生理功能。16sRNA微生物测序的实验结果显示在给抗生素小鼠灌胃A.muciniphila或者Amuc_1100后恢复了抗生素处理小鼠的肠道微生物的量和种类。这不仅有助于明确A.muciniphila与宿主相互作用的具体机制，也有助于解释A.muciniphila和Amuc_1100在改善宿主肠道功能、炎症和代谢紊乱等方面的作用途径。本研究不仅明确了A.muciniphila与宿主相互作用的分子机制和途径，也为设计靶向治疗肠道相关疾病药物的开发奠定了基础。
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