摘要
背景和目标： 随着生活条件的改善与乙肝疫苗的普及，脂肪性肝病已成为影响肝脏健康的重要疾病。无论是酒精性还是非酒精性脂肪性肝病，若不加以干预任由疾病发展，都存在从肝脂肪变性发展为：脂肪性肝炎、肝硬化甚至是肝细胞癌的可能。终末期肝病难以逆转，严重影响社会劳动力与人民健康。由于脂肪肝发病机制复杂，缺乏针对性治疗靶点，对其发病机制与治疗方法的研究具有非常重要的社会意义。 近年来，许多研究发现：肠道微生态与脂肪性肝病有着密切的联系。肠道微生态紊乱已被证实会增加肝内脂肪堆积，引发脂肪性肝炎。同时，脂肪性肝病小鼠来源的粪便移植会加剧高脂饮食组小鼠的肝脏损伤。本团队前期研究表明：基于肠道微生态的LGG-s治疗可以改善酒精性脂肪性肝病，平衡Th17和Treg细胞；骨髓间充质干细胞治疗也可以通过调节Th17和Treg细胞，减少酒精对肝脏的损伤。为了明确干细胞治疗与微生态治疗是否存在协同效应；探索其具体的分子生物学机制，设计了相关第一部分实验进行验证。 根据本团队前期研究，通过调整Th17/Treg比例，酒精对肝脏的损害可以在一定程度上减轻。但免疫细胞调节的具体机制和其中涉及的关键基因或蛋白，目前仍尚未明确。生物信息学能够快速地对大量数据进行批量化计算与分类，从复杂的数据中出筛选出关键信息，减少工作量的同时极大地提高分析的效率。为了研究脂肪肝Th17/Treg数量变化背后的关键机制并减少不同批次测序数据中差异基因的异质性，设计了第二部分研究工作，通过生物信息学进行脂肪肝免疫细胞紊乱现象背后的机制探索。 材料与方法： 1.鼠李糖乳杆菌购自美国模式菌种收集中心(ATCC53103，Rockville，MD)，并按培养指南在MRS肉汤培养基中培养。当LGG浓度达到109个菌落形成单位/毫升(cfu/ml)时，取菌液在4℃、5000g/min的条件下离心10分钟后取上清弃沉淀，用0.22mm滤膜过滤收集鼠李糖乳杆菌培养上清液(LGG-s)。LGG-s储存在-4℃以备使用。 2.小鼠骨髓间充质干细胞购自赛业生物科技有限公司(MUBMX-01001,Cyagen Biosciences,US)，并按指南在OriCellTM C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞完全培养基中(MUBMX-90011,Cyagen Biosciences,US)培养。取第8-9代细胞用于小鼠尾静脉注射。 3.6周龄C57BL/6雄性野生型(WT)小鼠，体重18~20g，购自上海实验动物中心。之后通过Lieber-DeCarli对照饲料进行为期2周的适应性液体饮食喂养。2周后，除正常对照组小鼠外其余各组小鼠，分别在第2、4、6天改变比例，以2∶1，1∶1至1∶2的配比混合Lieber-DeCarli对照饲料与Lieber-DeCarli乙醇饲料(5%乙醇)，进行为期一周的酒精饲料过渡喂养。适应结束后，给予上述各组小鼠完全的Lieber-DeCarli乙醇饲料。实验分为5组，每组6只：第1组：正常对照组(N)，仅给予Lieber-DeCarli对照饲料；第2组：酒精模型组(M)，给予Lieber-DeCarli乙醇饲料4周；第3组：LGG-s治疗组(L)，给予Lieber-DeCarli乙醇饲料+LGG-s(相当于109cfu/ml/d)；第4组：骨髓间充质干细胞治疗组(B组)：采用Lieber-DeCarli乙醇饲料加尾静脉注射BMMSCs治疗，每周1次，从第2周开始、第3周、第4周共3次；第5组：LGG-s和BMMSCs治疗组(LB)，Lieber-DeCarli乙醇饲料加LGG-s和BMMSCs的联合治疗，干预方式同第3组和第4组所述。第7周末，收集组织样本处死小鼠。 4.血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)在温州医科大学附属第一医院临床生化实验室用全自动生化分析仪(AU5800,Beckman Instruments,America)进行检测。 5.肝脏组织切片通过HE染色和油红O染色后，使用数字图像分析仪(KS400，Carl Zeiss Vision,Germany)观测每张幻灯片，由一名技术人员在不知道组织分组的情况下随机在组织切片上选取3个视野；再由两位不知道实验内容与分组信息的临床病理学家进行组织学评估。RT-PCR由7500实时PCR系统(Applied Biosystems,Life Technologies,USA)进行，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为参照基因，计算Raptor与Rictor的mRNA表达值。最终数据采用2-Δ-Δ-CT方法进行分析。Western blot检测与分析是将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上(Immobilon-p，Darmstadt，Germany)经第一抗体与第二抗体先后孵育,再以ECL试剂盒(Thermo,Massachusetts,USA)通过化学发光检测蛋白水平;使用Bio-RAD ChemiDoc XRS(Bio-RAD,California,USA)获得反应条带图像;用软件Image Lab(Bio-RAD,California,USA)测量条带的蛋白浓度值。流式细胞术是取各组小鼠脾脏研磨后使用PBS洗涤并重悬获得单细胞悬液进行抗体孵育与信号分析。NKB细胞定义为CD19+NK1.1+CD3-B细胞，TFH细胞定义为CD4+CXCR5+T细胞。通过BD FACSCalibur平台(BD Bioscience,CA,USA)检测，用FlowJo软件分析NKB细胞占B细胞总数的百分比和TFH细胞占淋巴细胞总数的百分比。 6.各实验统计分析均在SPSS22.0软件中进行计算，多组数据之间的差异统计分析采用多因素方差分析(ANOVA)、LSD和Dunnett T3检验。P值＜0.05被认为有统计学意义。 7.生物信息学分析部分是通过R(version3.4.0)软件使用Limma功能包对表达矩阵进行差异基因筛选，本研究中选择差异基因的标准为：|logFC|＞2并且adj.P.value＜0.01；使用ggplot2功能包对差异基因进行火山图绘制；使用VennDiagram功能包对差异基因列表进行2元韦恩图绘制。通过WebGestalt程序进行gene oncology富集分析，通过KEGG软件进行蛋白细胞通路富集分析。P值由超几何分布检验计算所得（hyergeometric test），PValue＜0.05被认为具有统计学意义。蛋白互作用网络分析在NetworkAnalyst软件中进行，使用Cytospace软件对互作用分析图进行编排美化。最后通过Targetscan软件对目的蛋白进行miRNA靶基因预测。 结果： 第一部分 1.液体饮食喂养下各组小鼠的体重均增加，实验结束时，不同组小鼠的体重非常接近，虽然对照组小鼠的体重平均值略大于其他组小鼠，但差异不具有统计学意义。与Lieber-DeCarli对照饮食喂养的小鼠相比，Lieber-DeCarli乙醇饮食喂养的小鼠血清ALT和AST水平均显著升高。此外，与对照组相比，LGG-s、BMMSCs或LGG-s和BMMSCs的联合治疗显著降低了血清ALT和AST水平。 2.与对照组小鼠相比，模型组小鼠肝脏损伤与肝内脂质沉积显著。LGG-s、BMMSCs以及LGG-s和BMMSCs联合治疗显著减轻了肝损伤，但并不能完全逆转肝损伤；所有三种治疗方案都减少了肝内脂肪沉积，但没有使肝脏中的脂肪沉积恢复到正常小鼠肝脏的水平。 3.蛋白免疫印迹显示：相较于模型组，3种不同治疗方案的治疗组p-NF-kB、p-mTOR和p-PI3K均明显减少,联合治疗组减少最为显著，差异具有统计学意义。 4.不同方案治疗组肝内Raptor的mRNA水平均相较对照组出现了下降，而Rictor的mRNA反而都表现出了升高趋势。在联合治疗组中，Raptor的升高与Rictor的降低均最为显著。LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白是自噬的标志，在Lieber-DeCarli乙醇饲料喂养的模型组小鼠中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较对照组小鼠有所增加，除了LGG-s和BMMSCs联合治疗的小鼠外，其他各组之间的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例没有统计学意义上的差异，这表明LGG-s和BMMSC联合治疗可能对自噬有影响。 5.模型组小鼠脾脏中的NKB细胞显著增加。所有三种方案的治疗都减少了脾脏中NKB细胞的数量，其中在LGG-s和BMMSCs联合治疗的小鼠中观察到的脾脏NKB细胞减少情况最为显著。TFH细胞数量变化也呈现了相似的趋势。 第二部分： 1.从GSE89632数据集中选得到41个差异基因，从GSE24807数据集中筛选得到568个差异基因。（选择差异基因的标准为：|logFC|＞2并且adj.P.value＜0.01） 2.筛选出8个共同表达上调差异基因，2个共同表达下调差异基因。共同表达上调差异基因为：IGFBP1，FOS，SLITRK3，S100P，ARL14，SIK1，RASD1，CALCA；共同表达下调基因为：GCK，CYP7A1 3.8个共同上调差异表达基因涉及以下生物学过程：衰老、摄食行为、妊娠、条件性厌食、多细胞生物过程、对温度刺激的反应、对重力的反应、骨吸收的负调节、全身动脉压调节和全身动脉压的负调节。在这10个生物学过程中，有7个过程含有FOS基因。8个共同上调差异表达基因参与组成下列细胞成分：微绒毛膜、细胞突起、肌浆网、神经末梢、微绒毛、轴突末端和神经元突起。8个共同上调差异表达基因拥有以下分子功能：胰岛素样生长因子Ⅱ结合、RAGE受体结合、胰岛素样生长因子Ⅰ结合、GTP结合、鸟苷酸结合、R-smad结合、胰岛素样生长因子结合和RNA聚合酶Ⅱ核心启动子序列特异性DNA结合。 4.在蛋白互作网络图中，我们筛选出了7个关键基因（至少2个以上蛋白有交互作用）；其中4个是我们筛选出的共表达上调差异基因：FOS、IGFBP1、SIK1和S100P。在KEGG通路分析的结果中，FOS几乎涉及每条通路，IL-17信号通路也是其中之一。 5.我们找到了23个FOS可能的保守miRNA，和566个欠保守miRNA，其中miRNA-29c有着最高的预测调控FOS可能性。MiRNA29c-3p与FOS在3’UTR365-371处结合，结合区域为7mer-m8，保守分支长度4.501。miRNA-29c-3p能够通过与FOS基因结合调节IL-17通路影响Th17细胞数量。 结论： LGG-s联合骨髓间充质干细胞治疗酒精性脂肪肝比单一方案治疗更能有效减轻酒精性脂肪肝的肝脏损伤。联合治疗的增强作用可能是通过PI3K/NF-kB和PI3K/mTOR信号通路调节炎症和自噬。此外，LGG-s联合BMMSCs治疗酒精性脂肪肝也与其能够调节NKB与TFH细胞数量有关。 miRNA与FOS在脂肪肝中可能起到重要作用，其原理是通过调控IL-17信号通路影响下游Th17细胞。
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