摘要
化疗是治疗中晚期癌症的有效方式。然而传统的小分子化疗药物由于在水中溶解度低、药物半衰期短、肿瘤靶向性性差等缺陷，无法取得理想的治疗效果且伴随着严重的全身毒性。近年来，聚合物纳米药物由于可改善药代动力学及增强肿瘤富集能力备受关注，其中，有几款纳米药物已在临床上上市。虽然它们能有效降低对正常组织的毒性，但并未在整体上提高患者的生存率。究其原因：第一，不能精确控制药物成分，不同批次间存在较大差异；第二，药物体内循环不稳定，常过早释放；第三，无法精准靶向肿瘤部位，且单药物用药时会导致肿瘤细胞耐药。刺激响应性聚合物纳米前药具有精准的结构和药物组成且可响应肿瘤微环境，有望用于设计理想的纳米药物。然而其大多数只能响应肿瘤胞内刺激因子，无法对肿瘤胞外微环境做出响应，限制了纳米药物在肿瘤部位的富集能力。因为纳米药物在肿瘤胞外理化性质的改变如粒径动态变化、电荷翻转以及形状改变等可增强纳米药物渗透、滞留以及易于被癌细胞摄取的能力。所以，有必要开发肿瘤胞内外微环境超灵敏响应的聚合物纳米前药。 聚原酸酯作为一种酸敏感生物材料，其酸响应性与附近的亲水和疏水性结构有关，通过结构调节，聚原酸酯可响应肿瘤胞内外的较低的pH；另外，顺铂（Pt）和去甲斑蝥素（DMC）作为一线化疗药物，作用机制不同且联合用药时可达到协同效果。基于以上研究背景，本研究拟根据肿瘤部位pH的梯度分布（血管：pH~7.4，胞外基质：pH~6.5-7.0，胞内：pH~4.0-6.0）以及胞内较高的谷胱甘肽（GSH）去构建肿瘤微环境超灵敏响应的聚合物纳米前药协同输送体系。首先以最优比例合成顺铂-去甲斑蝥素小分子前药，然后交联主链聚原酸酯得到两亲性交联聚合物协同前药，进一步自组装形成纳米前药协同输送体系，结构中原酸酯及（去甲斑蝥素与氨基形成的）酰胺键发挥酸敏感功能，四价顺铂发挥还原敏感功能，从而实现：（i）在血液循环中稳定存在；（ⅱ）在肿瘤部位响应胞外微酸环境，通过尺寸和表面电位改变增强肿瘤富集及癌细胞摄取能力；（iii）到达胞内后进一步响应胞内微环境，快速释放药物以增强协同杀死癌细胞的能力。具体研究内容如下： 首先使用过氧化氢将二价顺铂氧化为四价顺铂Pt(Ⅳ)，再与DMC偶联形成双药物小分子交联剂Pt(Ⅳ)-1，然后与主链聚原酸酯POEAd-NH2通过酰胺反应交联，制备交联聚合物协同前药PPD。使用核磁共振氢谱（1H NMR）确认产物结构并计算出协同前药的载药量（Pt：7.4%，DMC：12.7%）。此外，顺铂的含量可以通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）进一步测定（7.9%±0.8%），通过摩尔比换算出去甲斑蝥素的含量（13.6%±1.38%），此结果与1H NMR计算出的结果相近，通过TNBSA法可以计算出交联度为52%。 使用溶剂交换法制备交联聚合物纳米前药协同输送体系，利用动态光散射仪（DLS）测得平均粒径为204.7nm，平均zeta电位为-23.7mV；以尼罗红为荧光分子，使用荧光分光光度计测得纳米前药的临界胶束浓度（CMC）为1×10-3mg/mL。以上结果说明纳米前药具备合适的粒径和电位以及较小的CMC，有利于血液循环稳定。利用1H NMR跟踪实验测定主链中原酸酯的水解速率，原酸酯键24小时内在pH=7.4、6.8和5.0降解比例分别为0%、40%和100%，说明纳米前药在血液循环中可稳定存在并且可响应肿瘤胞内外微酸环境，具有pH超敏感性。进一步通过磷酸缓冲液和谷胱甘肽溶液模拟了纳米前药在体内不同生理环境的粒径和电位变化行为。结果表明，在pH=7.4时可保持粒径及电位的长期稳定，而在pH=6.8时则有增大的趋势，在pH=5.0条件下纳米前药快速崩解。上述粒径变化行为有利于维持血液循环稳定，增强肿瘤靶向富集、癌细胞摄取以及胞内高效释放药物的能力。使用透析法测定不同生理条件下药物释放行为，24小时内纳米前药在pH=7.4时释药约15%，在pH=6.8时释药约30%，在pH=5.0/GSH时释药80%左右。药物释放结果表明，纳米前药释药行为和粒径变化行为密切相关，并且较高的肿瘤胞内药物释放有利于高效杀死癌细胞。 选用HepG2和H22细胞通过MTT法和凋亡实验发现交联聚合物纳米协同前药的细胞毒性、促凋亡能力与Pt/DMC相似。利用共聚焦显微镜和细胞流式术考察了细胞对交联聚合物纳米协同前药的定性/定量摄取能力，结果显示纳米前药可被癌细胞有效摄取并且在pH=6.8摄取更显著，暗示肿瘤胞外氨基电位变化有利于细胞摄取。使用H22细胞建立小鼠肿瘤模型，检测药物在血液及肿瘤的含量，结果表明交联聚合物纳米协同前药相较于游离的药物可以在血液中稳定循环且增了药物的肿瘤选择能力；进一步抑瘤实验结果证明，相比两种游离的药物，交联聚合物纳米协同前药可显著抑制肿瘤增生。另外，从小鼠体重变化及病理组织切片可以看出，交联聚合物纳米协同前药可显著降低毒副作用，增强肿瘤组织破坏能力。 综上所述，通过协同小分子前药交联聚原酸酯构建的精准协同纳米药物输送体系，一方面可在血液循环中稳定存在，另一方面可高效响应肿瘤胞内外生理微环境，通过粒径及电位的动态变化增强肿瘤靶向富集、细胞摄取以及协同杀死癌细胞的能力，呈现出优异的抗肿瘤效果。通过进一步结构优化及功能表征，肿瘤微环境超灵敏响应的纳米前药有望应用于临床癌症的靶向精准治疗。
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