摘要
水稻细胞质雄性不育（CMS）是研究植物核质互作的理想材料和水稻杂种优势的基础。D1型CMS水稻是以东乡野生稻为优异质源，培育出的一种独立于野败型的，无花粉型败育的新型孢子体CMS水稻。本实验室前期已经克隆并验证了线粒体基因Orf182为D1型水稻CMS基因，但其导致的相应的CMS机理尚不清楚。本研究拟通过对ORF182蛋白进行生物信息学分析、亚细胞定位、线粒体复合物分析以及寻找其互作蛋白，来初步阐述其在水稻CMS中的作用机制。现已获得如下结果: 1.Orf182相关载体构建及鉴定 通过PCR技术克隆了Orf182的CDS序列，并通过基因重组的方式将Orf182的CDS序列分别与亚细胞定位载体（HBT）、酵母双杂载体（PGBKT7和PGADT7）以及BiFc载体（PE3308和PE3449，SPYNE和SPYCE）进行同源重组连接，经测序，成功获得了Orf182的亚细胞定位载体，酵母双杂载体和BiFc载体。这些载体将在后续实验中使用 2.ORF182蛋白质结构与功能分析 通过生物信息学的方法对ORF182蛋白进行了预测，发现ORF182蛋白为不稳定的亲水性蛋白。该蛋白不存在跨膜区，且在膜外侧，二级结构多为α-螺旋和无规则卷曲，三级建模的同源性在35%以下。 提了取水稻D1型不育系（DPA）和保持系（DPB）的线粒体，通过超速离心，对线粒体进行了对线粒体进行了外膜（OM）、膜间质（IMS）、包含内膜和基质的完整结构（mitoplast）等亚组分分离实验，Western-Blot结果显示，ORF182信号位于线粒体mitoplast。 此外，利用蓝绿温和胶电泳技术（BN-PAGE）分别分析了DPA及DPB线粒体呼吸链复合物的差异。发现DPA线粒体蛋白复合体Ⅰ、Ⅱ的含量低于DPB中的含量，而复合体Ⅴ的F1亚基含量在DPA却高于DPB。进一步，对复合体Ⅰ进行了胶内酶活显色，发现DPA线粒体中的复合体Ⅰ的酶活高于DPB线粒体中的复合体Ⅰ酶活。 以ORF182蛋白为诱饵蛋白，对F1代花药酵母文库进行了筛选，发现三次重复实验都只有1个候选基因Os03g0721200，并命名为HEAT。后续将通过构建相应载体并进行点对点来验证Orf182和HEAT是否存在互作。 提取了带有tag标签的orf182转基因植株和中花11的总蛋白，进行了Co-IP实验条件优化摸索，发现用Flag标签抗体更优。对DPA和DPB的线粒体蛋白Co-IP进行了预实验，摸索出了相应的Co-IP实验条件。 3.绒毡层凋亡相关基因的表达 实验室前期通过石蜡切片发现，DPA和DPB的花药在小孢子母细胞减数分裂期就开始出现差异，这些差异可能是由于绒毡层推迟降解而导致。本研究对绒毡层凋亡相关基因（MS1、GAMYB、UDT1、TDF1、TDR、RAFTIN1、CYP703A3、CYP704B2、C4、ADF、CP1、EAT1、AP25和AP37）分别在在不育系（DPA）和保持系（DPB）5个不同发育时期（小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、小孢子早中期、小孢子晚期和二孢花粉及成熟期）中的表达进行了检测。结果表明这些基因在DPA和DPB不同发育时期花药中的表达差异显著。
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