摘要
实验目的： Leber’s遗传性视神经病（Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON）是视网膜病变的一种类型，主要累及视网膜神经节、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性病变。LHON是与线粒体基因组突变相关的最常见的母系遗传性线粒体功能紊乱疾病。据世界卫生组织统计，中国是全球视力损伤人口最多的国家，其中LHON患者约占5%。患者往往在青少年时期便失去视力，疾病深切影响了患者的生活质量，并造成了一定的社会负担。本研究主要对构建转线粒体胞杂合细胞进行分子生物学和细胞生化功能分析，通过蛋白质印迹分析和流式细胞分析仪以及免疫荧光检测等方法探究线粒体m.5587A＞G突变对细胞氧耗，蛋白表达线粒体凋亡和线粒体自噬通路的影响。通过Northern Blot和tRNA3''端剪切等体外加工实验探究与Leber’s遗传性视神经病变（LHON）相关的tRNAAla5587A＞G突变的分子机制以及该突变如何影响tRNA受体茎3''端73位的高度保守的腺苷位点和tRNA的熔融温度变化，探讨该变化影响线粒体的转录翻译功能的机制。从而进一步探讨线粒体m.5587A＞G突变在Leber’s遗传性视神经病变（LHON）致病机制中发挥的作用，为后续针对性的分子生物层面治疗提供理论支持及赢得了宝贵时间。 实验方法： 在这个项目中，首先对收集的1280名LHON家庭成员的中国汉族家庭成员进行筛选，寻找三个主要的突变位点，将报告表分类并反馈给患者，并给予患者科学合理的解释。其次，对收集到的家族进行了线粒体tRNA基因突变分析，通过测序技术筛选与LHON相关的tRNAAla基因的新突变位点。对于具有tRNAAla5587A＞G突变的先证者及其家属和正常对照个体，建立永生的淋巴细胞系和转线粒体细胞系（cybrids）。进行野生型和突变型tRNA体外加工功能进行分析，包括紫外熔融温度测定，tRNA3’端剪切能力分析，线粒体tRNA CCA添加活性测定，tRNA稳态以及氨酰化能力分析。对各细胞的线粒体相关功能进行分析，包括线粒体复合体Ⅰ，复合体Ⅳ酶活性，线粒体膜电势测定，线粒体自噬凋亡功能和氧气消耗速率（OCR）,氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）清除水平以及线粒体相关蛋白表达等关键指标之间的差异。 实验结果： 线粒体m.5587A＞G突变影响了tRNA受体茎3''端73位的高度保守的腺苷位点，通过内部结构的相互作用而影响其稳定；体外加工实验表明，m.5587A＞G突变使得tRNAAla融解温度升高，tRNA结构变得异常；m.5587A＞G突变影响了ELAC2催化的tRNAAla前体的3''末端加工反应和TRNT1催化的tRNAAla的CCA末端添加效率。Northern Blot分析结果显示，m.5587A＞G突变扰乱了tRNAAla的结构稳定状态和氨酰化作用。m.5587A＞G突变能够影响线粒体氧化磷酸化功能异常，表现在突变使细胞氧气消耗速率下降，导致呼吸不足和呼吸潜力下降，同时ROS水平的持续升高，ATP产生量下降，氧化磷酸化复合体酶活性下降，以及线粒体相关蛋白的表达水平降低。线粒体m.5587A＞G突变还引起了细胞凋亡自噬水平的改变。 实验结论： 线粒体m.5587A＞G引起熔融温度升高，该位点突变使得tRNA结构稳定性下降，导致前体tRNAAla3''末端加工和tRNAAla的CCA末端添加反应效率下降。进一步导致tRNA稳态和氨酰化水平下降。突变扰乱了tRNA正常的转运及翻译相关功能，从而影响了线粒体氧化磷酸化功能，表现在线粒体超氧化物增加，ATP产生量下降，氧化效率下降，线粒体复合体酶活性降低，相关蛋白表达水平下降。同时m.5587A＞G突变加速了细胞凋亡自噬速率。因此，m.5587A＞G突变与LHON具有相关性，但还不足以出现明显的LHON临床表型，需要其他遗传修饰或环境因素的参与。
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