摘要
研究背景: 肺癌是全世界男女性癌症相关死亡的主要原因，对全球人类健康已经造成了极大的威胁。在所有癌症中，肺癌在大多数国家的死亡率最高，其中以欧洲和北美等工业化地区尤为突出。在中国，登记的肺癌死亡率在过去30年中增长了464.84%。在美国，美国癌症协会预测2020年将诊断出228,820例肺癌和支气管癌，其中死亡病例135,720。根据2015年世界卫生组织(WHO)公布的肺肿瘤分类，原发性肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占80%，包括腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、大细胞神经内分泌癌和大细胞癌。肺腺癌是肺癌最常见的组织学亚型，占所有肺癌的40%。虽然近年来靶向基因突变的肺腺癌患者生存率有所提高，但由于缺乏早期诊断特异性手段，导致肿瘤进展到晚期并发生广泛转移，使得肺腺癌的死亡率仍然很高，其总体5年生存率不足20%。因此，寻找具有特异性和敏感性的肺腺癌诊断标志物，对推动肺腺癌的早期诊断、提高患者生存率具有重大意义。 METTL7B（methyltransferase-like7B，甲基转移酶样蛋白-7B）是甲基转移酶样蛋白家族中的一员，该家族由27个以上的成员组成，但其功能尚未被充分阐明，其中METTL7A与METTL7B关系密切，两者具有59%的序列同源性，其中针对METTL7A的研究更为广泛，研究表明其在肝细胞癌、甲状腺癌、肺腺癌和乳腺癌中发挥重要作用。最近，METTL7B受到了更多的关注。最初，人们发现METTL7B是一种与高尔基相关的甲基转移酶，其功能尚未确定，后来发现METTL7B与严重先兆子痫、非酒精性脂肪性肝炎、脂质代谢和感染等多种疾病相关。越来越多的证据表明METTL7B在恶性肿瘤进展中发挥重要作用，其中包括原发性甲状腺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。在原发性甲状腺癌中，METTL7B表达上调，通过促进肿瘤生长因子β-1(TGF-β1)诱导的上皮间质转化，促进甲状腺癌细胞的迁移和侵袭；在乳腺癌中，METTL7B表达降低引起高尔基复合体的分裂，从而增强肿瘤细胞的侵袭性；在肺癌中，最近的一项研究表明METTL7B在NSCLC肿瘤组织中过表达，并通过调节细胞周期进展促进肿瘤发生。然而，METTL7B在肺腺癌中的表达意义以及作为潜在生物标志物的诊断价值有待进一步证实，其在肺腺癌中的生物学功能也需进一步阐明。 研究目的： 1.探究METTL7B对肺腺癌细胞增殖、迁移的作用，为肺腺癌提供新的治疗靶点。 2.明确METTL7B在肺腺癌临床样本中的表达情况及临床意义，为METTL7B可作为肺腺癌潜在早期诊断标记物及预后预测分子提供依据； 研究方法: 1.METTL7B对肺腺癌细胞增殖、迁移的影响 通过qPCR和westernblot对6株人肺腺癌细胞系(H1299、H1975、A549、H827、PC9、SPCA1)和对照组正常人肺上皮细胞(BEAS2B)分别在mRNA和蛋白水平上检测METTL7B的表达。利用慢病毒介导的两种不同的短发夹RNA(shRNA1和shRNA2)在H827和A549细胞中对METTL7B的表达进行干扰，通过westernblot验证干扰效果，然后通过CCK-8实验检测细胞增殖、划痕实验检测细胞迁移能力、细胞Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力，从而评估METTL7B对肺腺癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响，进而明确METTL7B在肺腺癌中的生物学功能。 2.METTL7B在临床肺腺癌组织中的表达及意义 通过对含有肺腺癌肿瘤组织(n=96)及对应的癌旁正常组织(n=77)的组织芯片样本进行免疫组化染色（IHC），检测临床肺腺癌患者组织样本中METTL7B的表达情况，同时收集患者的临床病理特征和预后信息，对METTL7B与临床信息行相关性分析，探讨METTL7B的组织学表达临床意义。 3.METTL7B在临床肺腺癌血清中的表达及意义 收集两个独立临床队列（训练队列与验证队列）的血清样本，训练队列包含健康正常对照组(n=35)和肺腺癌组(n=30)，对两个队列样本进行METTL7B蛋白的 ELISA检测。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价METTL7B作为肺腺癌诊断的血清生物标志物的潜在价值，并与传统临床肺癌血清生物标志物(CEA、CYFRA21-1、SCC)进行比较，确定METTL7B作为肺腺癌血清诊断标志分子的敏感性和特异性，以及预测肺腺癌的最佳阈值水平。 研究结果： 1.METTL7B促进肺腺癌细胞增殖、迁移 qPCR和westernblot检测结果一致表达所有肺腺癌细胞系中METTL7B水平明显高于正常的人肺上皮细胞，其中以A549和H827细胞的内源性METTL7B过表达尤为明显。使用两个shRNA均有效地对A549和H827细胞系中的METTL7B表达进行干扰，导致METTL7B的表达降低。CCK8实验结果表明干扰METTL7B表达可抑制肺腺癌细胞的增殖能力，划痕实验与侵袭实验结果表明干扰METTL7B表达可抑制肺腺癌细胞的迁移侵袭能力。 2.METTL7B在肺腺癌组织中高表达且与不良预后有关 免疫组化结果显示，METTL7B主要分布在肺腺癌患者肿瘤组织的细胞质中，且METTL7B在肺腺癌肿瘤组织的表达水平明显高于癌旁组织。相关性分析结果表明肺腺癌组织METTL7B表达水平与性别、TNM分期、肿瘤分级显著相关。Kaplan-Meier生存分析显示，METTL7B高表达的肺腺癌患者生存率明显降低。在对肺腺癌患者总生存期相关因素的单因素分析中，METTL7B高表达与总生存期显著相关，是预后不良的独立危险因素。 3.METTL7B在肺腺癌患者血清中高表达并可作为新分子诊断标志物 ELISA检测结果显示训练及验证队列中肺腺癌患者的平均METTL7B水平均显著高于健康组(对照组)，提示血清METTL7B水平对肺腺癌的诊断意义。ROC结果显示无论在训练或验证队列中，METTL7B的诊断效能优于CEA、CYFRA21-1和SCC。以86.48(ng/ml)为METTL7B诊断肺腺癌阈值，该预测诊断模型在验证数据集中的敏感性和特异性分别为76.67%和76.00%。 结论： 1.METTL7B对肺腺癌细胞的增殖和迁移具有明显促进作用，这些发现为肺腺癌的治疗提供了新的靶点。 2.METTL7B表达水平与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移显著相关，表明METTL7B与肺腺癌的恶性进展息息相关，提示METTL7B可预测肺腺癌患者的预后。 3.METTL7B可作为肺腺癌血清学诊断分子标志物，为肺腺癌的无创性早期诊断提供新的方向。
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