摘要
目的 建立灵芝子实体益生菌发酵体系，并研究灵芝子实体益生菌发酵液在肠道屏障受损以及免疫力低下动物模型中的防治作用及机制，为开发防治相关疾病的新型药食同源制剂提供新思路和数据支持。 第一部分建立实验室灵芝子实体—益生菌发酵体系 1.材料与方法： 首先通过活菌计数的方法在枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌、短乳杆菌、假小链双歧杆菌、加氏乳杆菌6种益生菌中筛选出能在灵芝子实体液体培养基中正常生长的益生菌菌种；设置低、中、高三种灵芝子实体浓度：7.5mg/mL、15mg/mL、30mg/mL，再通过对灵芝子实体益生菌发酵液OD值及总糖含量的检测，确定适宜益生菌生长的灵芝子实体浓度。将优选的益生菌菌种在适宜的灵芝子实体浓度下与灵芝培养基进行共同发酵，液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）、pH检测分析灵芝子实体益生菌发酵液理化性质的变化。 2.结果 在益生菌的选择上，枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌能在富含灵芝子实体水提液的MRS肉汤培养基中正常生长。当灵芝子实体培养基浓度为30mg/mL时，枯草芽孢杆菌发酵液、嗜酸乳杆菌发酵液、嗜酸乳杆菌和短双歧杆菌混合菌发酵液的OD与总糖含量较高。因此采用枯草芽孢杆菌、混合益生菌（嗜酸乳杆菌和短双歧杆菌）作为益生菌菌种，灵芝子实体培养基浓度为30mg/mL的条件下制作灵芝子实体益生菌发酵液进行后续实验。HPLC-MS检测灵芝子实体益生菌发酵液发酵前后成分改变情况，经过枯草芽孢杆菌、混合益生菌（嗜酸乳杆菌和短双歧杆菌）发酵后发酵液中各种灵芝酸成分减少且pH值下降，且混合益生菌有将灵芝酸A转化成灵芝酸C2的功能。 3.结论 枯草芽孢杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌能分解利用灵芝酸成分，短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌对灵芝酸成分具有生物转化功能。 第二部分枯草芽孢杆菌—灵芝子实体发酵液治疗肠道屏障受损小鼠模型 1.材料与方法 对枯草芽孢杆菌-灵芝子实体发酵液治疗肠道屏障功能受损小鼠模型进行评价试验，40只健康SPF级雄性BALB/c小鼠（20±2g）随机分为五个实验组，分别是健康对照组(CON组)、肠屏障受损模型组(CS组)、枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液治疗组(FT组)、枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液预防组(FP组)、灵芝培养基组(GL组)。除CON组、FP组以外各组灌胃400mg/mL头孢曲松钠0.2mL，1天2次共7天建立肠道屏障受损模型。第8天起给予CS组MRS培养基0.2mL；FT组枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液0.2mL；GL组灵芝培养基0.2mL，连续7日。FP组前7日在灌胃头孢曲松钠造模基础上再给予枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液进行预防，后7日正常给予枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液0.2mL；CON组前7日灌胃生理盐水作为对照，后7日灌胃MRS培养基0.2mL，第15日处死各组小鼠。计算盲肠指数；苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，Hamp;E)检查结肠组织损伤水平；酶联免疫吸附测定(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)方法检测血清中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、白介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL-6）水平；流式细胞术比较各组小鼠脾脏免疫细胞亚群比例；16SrRNA高通量分析肠道微生态差异性。 2.结果 头孢曲松钠诱导小鼠肠道菌群失调并导致肠黏膜屏障功能受损，CS组小鼠体重减轻，盲肠肿胀，肠道通透性增加且有炎性浸润情况，脾脏成熟T细胞、CD4+T、CD8+T细胞过度上调；肠道菌群丰度及多样性减低且支原体菌属、肠球菌属丰度显著上升，乳酸杆菌属丰度下降。在枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液干预下FT组与FP组体重恢复到正常水平，结肠组织炎细胞浸润情况得到改善，肠道通透性下降，炎症因子含量及淋巴细胞比例趋于正常水平；增加肠道菌群中乳酸杆菌属、拟杆菌属、布劳特氏菌属相对丰度，减低支原体属、厌氧原体属、肠球菌属相对丰度。 3.结论 实验结果表明枯草芽孢杆菌-灵芝发酵液可以从降低肠道通透性、调节淋巴细胞比例、调整肠道菌群结构等方面改善肠道屏障功能受损。 第三部分混合益生菌（嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌）—灵芝子实体发酵液治疗免疫力低下小鼠模型 1.材料与方法 对混合益生菌（嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌)-灵芝子实体发酵液治疗免疫力低下小鼠模型进行评价试验，32只雄性BALB/c小鼠(20±2g)随机分为4组，包括正常对照组（CON组），免疫力低下模型组（DEX组），混合益生菌-灵芝发酵液组（FT组），灵芝子实体培养基组（GL组）。除CON组外其余3组小鼠每日腹腔注射地塞米松20mg/(kg.d)连续7天，建立免疫力低下模型。第8天起灌服CON组MRS培养基0.2mL，DEX组MRS培养基0.2mL，FT组混合益生菌-灵芝发酵液0.2mL，GL组灵芝培养基0.2mL，连续灌喂14日，第22日处死各组小鼠。测定各组脾脏指数，Hamp;E染色镜下评估结肠组织病理损伤，ELISA法检测小鼠血清IL-17、TNF-α水平，流式细胞术比较各组小鼠脾脏免疫细胞亚群比例，刀豆蛋白A（ConA）体外刺激脾脏淋巴细胞比较各组T淋巴细胞增殖反应，16SrRNA高通量测序分析肠道菌群结构；混合益生菌发酵灵芝酸A产物体外刺激派氏节细胞（PPs）后流式细胞术检测其中各淋巴细胞比例。 2.结果 DEX组小鼠出现免疫抑制的情况。与CON组比，DEX组小鼠结肠组织损伤严重，血清TNF-α水平上升，脾脏CD4+T、CD8+T、CD3+T淋巴细胞比例显著下降，脾脏淋巴细胞转化功能显著下降，肠道菌群丰度下降且乳酸杆菌属相对丰度显著减少、肠球菌属相对丰度增加。在嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌-灵芝子实体发酵液干预下FT组小鼠结肠组织学损伤、炎症浸润情况得到缓解，脾脏指数上升，血清TNF-α水平下降，脾脏CD4+T、CD8+T、CD3+T淋巴细胞比例增加，T淋巴细胞转化功能显著提高。混合益生菌（嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌）-灵芝子实体发酵液还增加FT组肠道菌群丰富度，恢复肠道菌群组成结构，特别是降低了免疫力低下小鼠肠球菌属的丰度，增加优质肠道菌群—乳酸杆菌属的丰度。混合益生菌灵芝酸A的发酵产物在体外可刺激小鼠派氏节CD4+T细胞增殖。 3.结论 实验结果表明混合益生菌（嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌）-灵芝子实体发酵液可以从抑制炎性细胞因子分泌、增强T淋巴细胞比例及功能、调节肠道菌群方面改善小鼠免疫抑制。
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