摘要
一、背景 当前，鲍曼不动杆菌（AB）在医院内的感染情况不容乐观，尤其是多重耐药的鲍曼不动杆菌（MDR-AB），已经成为威胁重症医学科住院患者生命的重要因素之一。在对AB的多种耐药机制的研究中，其生物膜所发挥的作用受到了越来越多的关注。目前，临床对于治疗MDR-AB特别是对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌（CR-AB）的方案相对单一，多黏菌素B已经成为治疗CR-AB的一线用药。本研究探讨多黏菌素B联合抗菌药物替加环素或阿奇霉素对AB标准株ATCCBAA-1605的生长抑制及对其生物膜活性的抑制，旨在为临床医师治疗CR-AB提供新的解决方案。 二、目的 1.测定AB标准菌株ATCCBAA-1605及其生物膜的生长曲线，并构建其生物膜模型。 2.测定抗菌药物多黏菌素B、替加环素及阿奇霉素对ATCCBAA-1605标准菌株的最低抑菌浓度（MIC）。 3.探究多黏菌素B联合替加环素及阿奇霉素对ATCCBAA-1605标准菌株抗菌作用。 4.探究多黏菌素B、替加环素及阿奇霉素对ATCCBAA-1605标准菌株生物膜形成的抑制作用及对已形成并成熟的生物膜的破坏作用。 三、方法 1.测定ATCCBAA-1605标准菌株的生长曲线，培育生物膜模型并测定其生长曲线：复苏ATCCBAA-1605标准菌株，并于96孔板中培养，每经过2h取出200μl菌液，置于600nm处测量其吸光度数值，测得ATCCBAA-1605生长曲线；在聚氯乙烯（PVC）材质的96孔板中培育ATCCBAA-1605标准菌株，3孔为一组，每经过24h取出一组，经结晶紫染色后观察生物膜的生长情况，并于595nm处测得其吸光度数值，测得其生物膜生长曲线，建立AB生物膜模型。 2.通过使用微量肉汤稀释法测定多黏菌素B、替加环素及阿奇霉素对ATCCBAA-1605标准菌株的MIC。并明确多黏菌素B联合替加环素或阿奇霉素对ATCCBAA-1605标准菌株的抗菌作用。 3.将ATCCBAA-1605标准菌株接种于灭菌处理后的PVC96孔板上，静置于37℃恒温培养箱中培养，分别在0h及24h予多黏菌素B、替加环素及阿奇霉素单独或联合干预24h，在结晶紫染色后于595nm处测量其吸光度数值，并在激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）下观察生物膜形态及生物膜内活/死菌数量变化情况。通过上述结果共同评价三种抗菌药物对ATCCBAA-1605的生物膜的抑制及破坏作用。 四、结果 1.在Luria-Bertani（LB）培养基中培养的ATCCBAA-1605，0~4h为该株的缓慢生长期；4h后，其进入对数生长期，对数生长周期为10h，经过连续培养14h后，细菌生长趋稳，此时该菌株进入稳定生长期；将ATCCBAA-1605标准菌株接种于灭菌处理后的PVC96孔板中。在24h时，经结晶紫染色后，96孔板中即可观察到少量紫色膜状，之后膜状物密度随培养时间的延长呈现出线性增加，培养至4d左右时，96孔板内形成高密度的生物膜。 2.抗菌药物的MIC：多黏菌素B2mg/L、替加环素2mg/L及阿奇霉素＞256mg/L。 3.部分抑菌浓度指数（FICI）：多黏菌素B联合替加环素的FICI为1.0625、多黏菌素B联合阿奇霉素的FICI值为1.5，该结果说明多黏菌素B与替加环素及阿奇霉素对ATCCBAA-1605的联合用药结果均为无关作用。 4.ATCCBAA-1605标准菌株接种于PVC材质96孔板中，0h即予不同浓度的多黏菌素B、替加环素及阿奇霉素干预24h。MIC浓度下多黏菌素B、替加环素及阿奇霉素对该株生物膜的抑制率分别为75.9%、67.3%及36.8%；浓度增加至2MIC时，其抑制率分别为81.7%、94.9%及44.4%。 5.ATCCBAA-1605标准菌株接种于PVC材质96孔板中，培养24h后，予多黏菌素B（4~2mg/L）分别联合替加环素（4~2mg/L）或阿奇霉素（512~256mg/L）干预24h后，在结晶紫染色下可观察到ATCCBAA-1605生物膜明显受到抑制，测OD595值显著低于对照组（Plt;0.001）；当替加环素（4~2mg/L）联合多黏菌素B（4~0.5mg/L），AB的生物膜生长也受到了明显的抑制；当阿奇霉素（128~64mg/L）浓度固定时，随着多黏菌素B浓度的逐渐降低，抗菌药物对AB生物膜抑制能力逐渐下降。 6.CLSM下观察：阿奇霉素（256mg/L）单独应用时，生物膜内活/死菌比例较对照组无明显变化。而单独应用多黏菌素B（4~2mg/L）或替加环素（2mg/L）时，生物膜内的死菌数量明显增多。多黏菌素B（4~2mg/L）分别联合替加环素（2mg/L）或阿奇霉素（256mg/L）时，生物膜内的死菌数量增加更为明显。 五、结论 1.体外实验证实多黏菌素B联合替加环素或阿奇霉素，对ATCCBAA-1605的联合药敏实验结果均为无关作用。 2.MIC浓度下的多黏菌素B及替加环素既可以抑制ATCCBAA-1605细菌生长，并且对其生物膜的生长抑制效果明显。MIC浓度下的阿奇霉素抑制ATCCBAA-1605生物膜的能力较差。 3.细菌培养初始时（即0h），予多黏菌素B联替加环素或阿奇霉素可有效抑制ATCCBAA-1605生物膜的形成。 4.生物膜形成早期（即24h），予多黏菌素B联合替加环素或阿奇霉素可以抑制生物膜的进一步成熟，并能杀灭生物膜中的活菌。
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