摘要
背景：N糖基化是蛋白质翻译后修饰中较常见的一种，大量研究表明蛋白质的N糖基化在癌症进展中起到了一定的作用，外泌体是富含多种蛋白质、核酸的胞外脂质单层囊泡，因此对外泌体N糖基化CD82及相关的microRNA在肿瘤细胞浸润和迁移过程中的作用机制成为本研究的主要出发点。CD82属于四跨膜蛋白，其胞外区有Asn129、Asn157和Asn198位点三个N糖基化位点，已有研究证实N糖链是CD82发挥肿瘤转移抑制作用的必要条件。因此CD82的N糖基化可能是它与其它分子之间相互识别的作用的重要基础，N糖链也是参与CD82在膜微区正确分布或四跨膜蛋白复合体形成的重要结构。阐明外泌体N糖基化CD82及microRNA抑制肿瘤转移过程中的作用可作为临床预测乳腺癌患者预后的肿瘤标志物，并为临床探寻阻断肿瘤转移的医治策略提供理论基础。 目的：本研究通过观察CD82N糖基化位点突变体在肿瘤转移过程中细胞生物学行为的改变以及外泌体在肿瘤转移过程中产生的作用和影响，初步阐明外泌体N糖基化CD82及microRNA调控肿瘤转移的分子机制，并结合临床血清标本进行验证，为乳腺癌患者的临床诊断和医治提供了新的思路。 方法：1.构建CD82N糖基化三位点突变的突变体以及CD82过表达细胞，应用慢病毒包装并转染乳腺癌细胞MDA-MB-231，通过qPCR技术及WesternBlot实验检测过表达和突变体细胞中CD82的表达水平。2.收集细胞上清，利用低温超速梯度离心方法提取外泌体，透射电子显微镜观察并鉴定其形态，WesternBolt实验鉴定外泌体的特征标记蛋白。3.通过细胞划痕实验、transwell实验分别检测CD82N糖基化突变体在细胞中和通过外泌体作用对细胞运动及迁移能力的影响。4.检测PI3K/AKT信号通路关键分子Akt及其磷酸化水平和EMT标志物E-cadherin、Ncadherin、Vimentin表达情况，探究CD82N糖基化突变体在肿瘤细胞转移中的调控机制。5.通过临床血清标本，探究和CD82具有较强相关性的microRNA，共同调控肿瘤细胞的转移。 结果：成功构建N糖基化三位点突变的CD82突变体，并通过慢病毒包装成功转染MDA-MB-231细胞。成功分离提取CD82过表达和CD82突变体的外泌体。以未做转染处理的野生型MDA-MB-231细胞组为对照组，通过划痕实验和transwell实验发现突变体细胞出现了CD82抑制肿瘤迁移功能的丢失，而CD82过表达组显示CD82具有抑制肿瘤转移的功能（p＜0.0001）。以未经过外泌体处理的野生型MDA-MB-231细胞作为对照组，突变体外泌体处理组与对照组比较出现了CD82抑制肿瘤迁移功能的缺失（p＜0.05）。在探究CD82N糖基化修饰对PI3K/AKT通路的影响显示，以未做转染处理的野生型MDA-MB-231细胞组为对照组，CD82过表达组与对照组比较出现了抑制Akt磷酸化的现象（p＜0.01），而突变体细胞则无明显变化。在对EMT标志物的检测中发现CD82过表达组中E-cadherin表达水平明显升高（p＜0.01），N-cadherin和Vimentin的表达水平明显降低（p＜0.05、p＜0.01）。以未经过任何外泌体处理的MDA-MB-231野生型细胞作为对照，结果发现经过CD82过表达细胞外泌体处理后的MDA-MB-231细胞同样出现了Akt磷酸化水平表达受抑制的现象（p＜0.05），而经过突变体细胞外泌体处理后的MDA-MB-231细胞则没有上述结果。经过CD82过表达细胞外泌体处理后的MDA-MB-231细胞出现了OVOL1表达水平升高（p＜0.05）、vimentin表达水平下降（p＜0.05）。对外泌体进行基因测序发现有多种microRNA和CD82之间存在相关性。以野生型MDA-MB-231细胞作为对照，CD82过表达组细胞中Mir-574-5p表达水平显著降低（p＜0.0001），Mir-17-5p表达水平显著升高（p＜0.0001）；而CD82N糖基化三位点突变体细胞组中Mir-574-5p和Mir-17-5p的表达水平均受到影响。临床血清样本中，Mir-574-5p、Mir-17-5p表达与CD82之间存在正相关（p＜0.05）。 结论：CD82N糖基化位点在维持CD82的运动迁移功能上起到了重要的作用。发生三点N糖基化突变的CD82降低了抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞运动迁移能力的功能。外泌体的N糖基化CD82能够影响乳腺癌细胞的运动迁移能力。CD82可分泌到外泌体中继续抑制肿瘤细胞的运动和迁移，而发生N糖基化突变的CD82在外泌体上则丢失其抑制运动迁移能力的作用。CD82N糖基化位点下调Akt/PI3K通路进而抑制EMT转化。外泌体CD82N糖基化通过下调受体细胞Akt/PI3K通路进而抑制受体细胞的EMT转化。CD82可能通过影响Mir-574-5p、Mir-17-5p进而抑制乳腺癌细胞的运动和迁移。CD82的糖基化修饰改变可能会影响Mir-17-5p的表达水平。Mir-574-5p、Mir-17-5p可以分别与CD82成为血清联合检测的肿瘤标志物，对乳腺癌的早期诊断和治疗方案提供新的策略。
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