摘要
目的：通过收集临床慢性根尖周炎患者根尖周组织，检测Nrf2在慢性根尖周炎中的表达情况；通过建立体外细胞炎症微环境模型，研究Nrf2在破骨细胞和成骨细胞中的表达情况及其对这两种细胞的增殖分化的影响，探讨Nrf2在慢性根尖周炎骨破坏中的作用机制。 方法:收集临床慢性根尖周炎患者根尖周组织样本、建立LPS介导的破骨细胞和成骨细胞炎症微环境，通过免疫组织化学实验、实时荧光定量PCR实验、蛋白免疫印迹实验等，研究Nrf2及相关因子的表达情况。 1、Nrf2在临床慢性根尖周炎组织中的表达 本实验样本取自于2019年1月至2020年12月就诊于大连医科大学附属口腔医院的临床患者，实验组临床诊断为慢性根尖周炎，需实施根尖外科手术治疗或拔牙术；对照组为正畸需要而拔除的健康前磨牙或因第三磨牙埋伏阻生而需拔除的第三磨牙根尖牙周膜组织。所有样本收集均取得大连医科大学伦理委员会批准及患者知情同意。将临床收集的组织，按照慢性根尖周炎肉芽组织和健康牙根尖周组织分别分为实验组32例和对照组22例，通过免疫组织化学实验分别检测实验组和对照组各6例样本中Nrf2的表达情况；通过实时荧光定量PCR实验分别检测实验组20例和对照组10例中Nrf2及TRAP的表达情况；通过蛋白免疫印迹实验分别检测实验组和对照组各6例样本中Nrf2和TRAP的表达情况。 2、Nrf2在LPS介导的炎症微环境中对破骨细胞和成骨细胞增殖分化的作用 （1）破骨细胞和成骨细胞诱导及鉴定 1）RANKL诱导液（0.1μg/ml）作用于RAW264.7细胞，采用光学显微镜观察、TRAP染色技术以及Real-TimeqPCR技术检测TRAP基因的表达，对破骨细胞进行鉴定。 2）成骨诱导液作用于MC3T3-E1细胞，采用ALP染色技术、茜素红染色技术以及Real-TimeqPCR技术检测ALP基因的表达，对成骨细胞进行鉴定。 （2）LPS介导的炎症微环境中，Nrf2在破骨细胞和成骨细胞中的表达 1）100ng/mlLPS作用于破骨细胞后，通过Real-TimeqPCR实验检测Nrf2、TRAP以及CTSK的基因表达，Westernblot实验检测Nrf2、TRAP以及CTSK的蛋白表达。 2）1000ng/mlLPS作用于成骨细胞后，通过Real-TimeqPCR实验检测Nrf2、ALP以及Runx2的基因表达，Westernblot实验检测Nrf2、ALP以及Runx2的蛋白表达。 （3）LPS介导的炎症环境中，下调Nrf2对破骨细胞和成骨细胞增殖分化的作用 1）将破骨细胞和成骨细胞瞬时转染Nrf2-siRNA后，对转染效率进行验证。 2）通过CCK8细胞增殖实验，检测下调Nrf2对破骨细胞和成骨细胞增殖的作用。 3）通过Real-TimeqPCR实验，检测下调Nrf2后破骨细胞TRAP及CTSK基因表达情况，成骨细胞ALP及Runx2基因表达情况。 4）通过Westernblot实验，检测下调Nrf2后破骨细胞TRAP及CTSK的蛋白表达情况，成骨细胞ALP及Runx2蛋白表达情况。 结果： 1、Nrf2在临床慢性根尖周炎组织的表达 免疫组织化学染色结果表明，Nrf2在6例临床慢性根尖周炎组织中的表达高于6例健康牙周膜组织（p＜0.0001）。Real-TimeqPCR检测结果显示，Nrf2及TRAP在20例临床慢性根尖周炎组织中的基因水平表达高于10例健康牙周膜组织（p＜0.05）。Westernblot检测结果同样显示，Nrf2及TRAP在6例临床慢性根尖周炎组织中的蛋白表达高于6例健康对照组（p＜0.05）。 2、Nrf2在LPS作用下对破骨细胞和成骨细胞增殖分化的作用 （1）破骨细胞和成骨细胞诱导及鉴定 1）对RAW264.7细胞诱导后，通过光学显微镜观察发现，细胞形态呈不规则形、类圆形，含有三个或三个以上的细胞核。Real-TimeqPCR检测结果显示，TRAP基因水平升高（p＜0.01）。TRAP染色结果显示，胞浆内含深褐色的酸性磷酸酶颗粒。以上结果表明RAW264.7成功诱导为破骨细胞。 2）对MC3T3-E1细胞诱导后，Real-TimeqPCR检测结果显示，ALP基因水平表达升高（p＜0.01）。ALP染色结果显示，胞浆内呈红色且颜色较未诱导细胞深。茜素红染色结果显示，有片状的暗红色钙化结节形成。以上结果表明MC3T3-E1成功诱导为成骨细胞。 （2）LPS作用下，Nrf2在破骨细胞和成骨细胞中的表达 1）LPS作用于破骨细胞后，Real-TimeqPCR结果显示，Nrf2、TRAP以及CTSK的基因水平表达升高（p＜0.05），通过Westernblot结果显示，Nrf2、TRAP以及CTSK的蛋白水平表达升高（p＜0.05）。 2）LPS作用于成骨细胞后，Real-TimeqPCR结果显示，Nrf2的mRNA水平表达升高，ALP以及Runx2的基因水平表达降低（p＜0.05），Westernblot结果显示，Nrf2的蛋白表达升高，ALP以及Runx2的蛋白表达降低（p＜0.05）。 （3）LPS介导的炎症环境中，下调Nrf2对破骨细胞及成骨细胞增殖分化的作用 1）转染效率的验证：细胞瞬时转染Nrf2-siRNA后，荧光显微镜观察结果显示，siRNA片段成功转入细胞。Real-TimeqPCR结果显示，Nrf2的基因水平表达降低（p＜0.05），Westernblot结果显示，Nrf2的蛋白水平表达降低（p＜0.05）。 2）CCK8细胞增殖实验结果显示，转染Nrf2-siRNA后促进破骨细胞和成骨细胞的增殖。 3）Real-TimeqPCR结果显示，转染Nrf2-siRNA后破骨细胞的TRAP及CTSK基因水平表达升高（p＜0.05），成骨细胞的ALP及Runx2基因水平表达升高（p＜0.05）。 4）Westernblot结果显示，转染Nrf2-siRNA后破骨细胞的TRAP及CTSK蛋白表达升高（p＜0.05），成骨细胞的ALP及Runx2蛋白水平表达升高（p＜0.05）。 结论：Nrf2参与慢性根尖周炎的疾病过程，在LPS介导的炎症环境中Nrf2可能通过调控破骨细胞和成骨细胞的增殖分化来参与根尖周炎骨破坏的发生发展。
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