摘要
糖化反应描述了淀粉基原料最终水解成单糖或低聚糖的过程，是淀粉深加工产业中的关键环节。目前在实际应用中通常使用葡萄糖淀粉酶等糖化酶催化进行糖化反应。该方法能满足生产的基本需求且污染较少，但仍存在耗能大、周期长等局限性。因此为了缩短糖化反应的时间，降低耗能，节约成本，寻求一种提高糖化反应效率的有效途径逐渐被人们所关注。超声作为一种绿色安全的非热加工技术，符合食品行业的生产要求，并已应用于多个食品加工领域。超声能对一些生物大分子，如淀粉等，产生良好的降解效果。与此同时，已有研究证实超声能够利用其独特的空化效应对许多生化反应进程产生加强作用。但将超声应用于淀粉糖化反应进程中的研究鲜有报道。 本研究选取葡萄糖淀粉酶作为糖化酶，围绕超声在淀粉酶促糖化中的应用展开研究、论述。基于动力学与热力学模型，从蛋白质结构，酶、底物特性和淀粉精细结构等方面入手，系统地研究了超声辅助酶促糖化反应的作用规律，分析了葡萄糖淀粉酶和淀粉的性质及结构的变化，深入探究了超声促进糖化反应的作用机制。从酶分子、反应体系和底物分子三个角度出发，系统地研究了超声对这三者的不同作用效果。通过对不同反应体系的比较，深入分析了超声在促进淀粉糖化过程的作用对象。主要研究内容和结果如下： （1）超声对葡萄糖淀粉酶的影响 通过DNS法建立葡萄糖淀粉酶的酶活力评价体系，测定在35~75℃的温度下，葡萄糖淀粉酶经超声（1.8~14.4W/mL）直接处理10~50min后的酶活力变化，用于分析超声对糖化反应的促进作用的形成原理。在处理温度为35℃、处理时间为20min的条件下，当超声强度不超过10.8W/mL时，超声不影响葡萄糖淀粉酶的酶活力；当超声强度大于10.8W/mL时，葡萄糖淀粉酶酶活力有轻微下降。处理温度极大地影响了超声对葡萄糖淀粉酶的作用效果，温度升高导致超声处理后的酶活力损失加大。在75℃时，酶活力损失严重。当超声处理时间长于40min后，酶活力开始下降。增加超声强度，延长超声处理时间，提高超声处理温度，会加大葡萄糖淀粉酶活力损失的概率，其中温度因素影响最大。在pH3.0~6.0范围内（包含酶的适宜工作pH范围），超声不改变葡萄糖淀粉酶的活力。超声降低了葡萄糖淀粉酶的热稳定性。在35和45℃时，超声对酶的热稳定性影响不大。随着温度的升高，酶的热稳定性降低明显，超声产生的不利影响加剧。 利用凝胶电泳，圆二色谱及荧光光谱手段对超声处理前后葡萄糖淀粉酶的蛋白结构进行研究。超声处理后酶蛋白的分子量未发生明显改变，无降解或聚集现象。在超声处理后的酶蛋白的二级结构中，α-螺旋，β-折叠，β-转角结构的含量减少，无规卷曲结构的含量增多，反映出超声导致了酶蛋白无序性的增强。三级结构的研究结果表明超声处理后酶蛋白表面色氨酸残基量减少。 （2）超声辅助淀粉糖化的作用规律和动力学研究 将超声与葡萄糖淀粉酶同时作用于淀粉，构建超声辅助酶促糖化的反应体系，研究糖化反应效率在不同超声处理条件下的变化规律。使用不同强度（1.8~14.4W/mL）的超声在25~75℃下处理葡萄糖淀粉酶和淀粉的混合反应体系，反应持续不同时间（10~50min），以单纯酶促糖化反应作为对照，研究超声对糖化反应的作用效果。结果发现超声能有效促进淀粉酶促糖化的进行，且其促进作用随超声强度的增大而增大，直至达到最适强度（10.8W/mL）。在35℃下，超声强度为10.8W/mL时，利用超声协同葡萄糖淀粉酶处理淀粉，可将糖化反应的时间从50分钟缩短至30分钟左右。但在较高温度（75℃）下，超声辅助糖化反应的效率显著下降，说明高温不利于超声辅助酶促糖化反应的进行。 利用米氏方程对反应的酶促动力学进行研究，发现超声能使反应的Km值降低，Vm值和Kcat/Km值增大。这体现了超声对酶-底物亲和力以及酶解效率的促进作用。利用一级反应动力学模型，研究在25~65℃时的超声辅助酶促糖化和酶促糖化反应中淀粉的降解动力学。结果表明，在25~55℃时，超声辅助糖化反应的降解速率常数分别提高了35.59%，33.16%，10.91%和13.74%，而在65℃时，却降低了14.78%。这说明在65℃时，葡萄糖淀粉酶的酶活力受到了超声的影响。超声辅助糖化反应的活化能Ea与反应焓ΔH比酶促糖化反应的更低，熵变ΔS绝对值更高。这表明了超声提高了糖化反应的效率，降低了反应所需的能量基线，使反应更加容易发生。 （3）超声辅助糖化反应对淀粉性质的影响 利用色谱技术，核磁共振技术及体外消化模型等分析手段对酶促糖化，超声处理和超声辅助酶促糖化反应所引起的淀粉理化性质和结构的改变进行研究。通过底物结构的变化，进一步明确超声辅助糖化的作用机制。在35℃，超声强度10.8W/mL的条件下，淀粉的分子量在各个反应中均随时间的延长有不同程度的降低，其中超声辅助糖化的降低作用最大（50min时降低至1.00×105g/mol），超声处理次之，酶促糖化远小于前两者。相比葡萄糖淀粉酶，超声引起的分子量降低更显著。淀粉分子量的降低导致了淀粉的溶解性的升高和淀粉糊粘度的降低。 通过对样品链长分布的研究可知，超声处理显著降低了直链淀粉的链长，但对支链淀粉的链长分布未产生影响。葡萄糖淀粉酶能有效降低直链淀粉和支链淀粉的链长，对于支链淀粉链长降低主要体现于外链上。超声辅助糖化能进一步促进葡萄糖淀粉酶缩短淀粉链。酶促糖化和超声辅助糖化反应使淀粉分支密度增加了76.0%和84.4%。超声由于对糖苷键的断裂没有选择性，故对淀粉的分支密度不产生影响。淀粉的消化特性在不同处理后变化不大，但酶促糖化处理后的淀粉样品消化性能略有提高。 （4）超声促进糖化反应的机理探究 通过DNS法比较酶促糖化反应，超声预处理淀粉后酶促糖化以及超声辅助酶促糖化反应的反应效率，明确超声促进糖化反应的主要形成原理。研究发现超声预处理淀粉能够一定程度上提高糖化效率，但其促进效果远低于超声直接作用于酶促反应体系。由此可知，超声在促进淀粉糖化反应的过程中，超声对反应体系的作用是主要原因，其次是超声对底物淀粉分子的作用。超声促进淀粉糖化的主要机理是超声对于整个酶解体系传质的促进，在超声条件下酶与底物的传质壁垒被削弱，底物与酶的结合以及产物与酶的分离加快。 通过碘结合分光光度法分析样品中直链淀粉和支链淀粉的变化，结果表明超声辅助糖化引起的直链淀粉含量降低程度相对较小。由于支链淀粉含有更多葡萄糖淀粉酶的可结合位点（非还原性末端），因此超声能更有效地促进支链淀粉的糖化。利用亚甲基蓝法测定超声处理过程中自由基含量的变化。在实验条件下，自由基的生成量不受超声强度影响，但随温度升高而降低，并随时间延长而积累。这一规律与超声引起的酶活力及酶解效率的变化不呈现相关性。由此说明在本研究中自由基效应不是引起葡萄糖淀粉酶失活和糖化反应效率增加的主要原因。
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