摘要
血吸虫病是由血吸虫引起的一种急性或慢性热带寄生虫病，在非洲，南美，东南亚的部分地区，特别是在撒哈拉以南非洲广泛分布，对人们生命和财产安全造成严重损害，据统计，2018年仍有2.29亿人处于血吸虫感染风险。我国流行的是日本血吸虫病，解放后我国进行了数十年的血防工作，顺利完成各个时期的既定目标，成效显著，但血吸虫病在我国并未消除，血防工作依然值得重视。 血吸虫成虫以雌雄合抱的形式存在，雌虫只有与雄虫合抱才能达到性成熟，性成熟雌虫所产的虫卵是造成宿主病理损害和疾病再传播的根源，雄虫通过某种非精子传递机制调控血吸虫雌虫的生长发育，了解雄虫对雌虫发育的影响对了解血吸虫的生殖发育机理以及对其传播的控制具有十分重要的意义。实验室前期的蛋白质组学研究结果发现，日本血吸虫糖基转移酶(SjGT)，日本血吸虫Nicastrin蛋白(SjNCSTN)以及日本血吸虫平衡型核苷转运蛋白3(SjENT3)在两性感染的合抱雄虫(MM)体内的表达高于其在单性感染雄虫(SM)体内的表达，推测这三个蛋白在日本血吸虫雌雄合抱，雌雄虫信息传递以及雄虫生殖器官发育成熟有一定作用。本论文围绕这三个蛋白做了以下的研究： 为了初步分析SjGT，SjNCSTN，SjENT3基因参与日本血吸虫的生长发育情况，本研究利用qRT-PCR分析了他们在日本血吸虫不同发育时间，不同性别，不同感染状态下的转录水平，结果发现，SjGT基因从7d到25d的转录水平呈现逐渐上升的态势，并在25d达到最高，在28d降至21d的转录水平，并在随后的时间里保持平稳。SjNCSTN基因的转录水平从7d到18d逐渐下降，之后有所回升，在25d之后的转录水平保持相对稳定。SjENT3基因的转录水平从7d到21d逐步上升，并在21d达到峰值，之后逐步下降，在42d降到最低点。 SjGT基因在各检测时间点雄虫体内的转录水平显著高于雌虫，其在雌虫体内的转录水平在各个时期都稳定在较低水平。SjNCSTN基因在各检测时期雌雄虫体内表达无明显差别。SjENT3基因在各检测时间点雄虫体内的转录水平高于雌虫，且此差异在生殖发育完善前更为明显。 SjGT基因在感染后18d，21d，23d，25dMM虫体的转录水平逐渐升高，并在21d时明显高于其在SM体内的转录水平，其在各检测时间点SM体内转录水平差别不大。SjNCSTN基因在感染后18d、21d、23dMM体内的转录水平显著高于其在SM体内的转录水平，其在感染后25d两种感染状态虫体间的转录水平基本一致。SjENT3基因在感染后18d两种感染状态虫体间的转录水平没有显著性差异，在感染后21d、23d、25dMM体内的转录水平显著高于其在同时段SM体内的转录水平。 本研究通过RNAi技术对SjGT，SjNCSTN，SjENT3基因生物学功能进行了初步的研究。利用筛选出的对这三个基因干扰效果较好的siRNA，进行体内长期干扰实验，特异性siRNA皆可明显抑制相应基因的转录水平。通过对长期干扰虫体成活率、每雌虫肝脏荷卵数、宿主肝脏荷卵数和肝卵孵化率进行统计分析发现，SjGT基因，SjNCSTN基因，SjENT3基因干扰组相较于NC组分别产生了28.89%（P＜0.05）、20.00%（P＜0.05）、24.45%（P＜0.05）的减虫率；宿主肝脏荷卵数分别降低53.08%（p＜0.01）、35.57%（p＜0.01）、57.47%（p＜0.01）；SjNCSTN和SjENT3基因干扰组的雌虫产卵能力分别下降21.84%（p＜0.05），42.28%（p＜0.01），长期干扰未对虫卵孵化造成有统计学差异的影响。激光共聚焦与透射电镜观察发现，长期干扰虫体的生殖器官产生了例如细胞间隙增大，细胞内空泡增多等不同程度的改变。 本研究融合表达了rSjGT和rSjNCSTN蛋白，并评估了其免疫保护效果，相较于对照组与PBS组，rSjGT与SjNCSTN蛋白免疫均引起明显的血吸虫雌虫产卵能力的下降和宿主肝荷卵的减轻，二者的免疫均未对血吸虫存活及虫卵孵化造成影响。ELISA检测免疫后的小鼠血清，三次免疫后特异性IgG抗体水平保持在较高水平。 本研究首先分析了日本血吸虫SjGT，SjNCSTN，SjENT3基因在血吸虫体内的表达情况，又通过RNAi方法初步分析了其可能的生物学功能，并评估了rSjGT和rSjNCSTN蛋白的免疫保护效果。
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