摘要
肿瘤细胞由于在表面过表达免疫抑制分子而逃避免疫监视。通过免疫检查点抑制剂来进行免疫检查点阻断（ICB）通常存在免疫应答率低（20-30％）和治疗费用高等缺点。近年来，通过RNA干扰技术对T细胞或肿瘤细胞进行基因修饰以降低免疫检查点分子的表达备受关注，例如，采用小干扰RNA（siRNA）沉默肿瘤细胞中的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）基因，以维持长期的ICB治疗和防止肿瘤复发和转移。然而，siRNA在递送过程中容易被酶降解，且固有的负电荷也阻止了它进入目标细胞，以至于难以实施高效的基因转染。因此，发展一种新型安全的基因载体递送siRNA对实施高效免疫治疗至关重要。 聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）作为一种优良的基因载体材料，具有基因压缩能力强、免疫原性低、转染效率高等突出优势，这归因于其高度支化、结构明确和丰富的表面氨基官能团等独特物理化学性质。在其表面功能化修饰（如PEG、两性离子、和糖基等）可大大提高其生物相容性，在其内部包裹金纳米颗粒后可保持其三维结构，从而使其基因转染效率显著提高。除了复合基因外，利用PAMAM还可以同时整合一种或多种有机/无机物，实现基因治疗/其他治疗（化疗、光热治疗等）的联合治疗。在本研究中，我们以包裹有金纳米颗粒的第5代（G5）PAMAM（AuDENPs）为纳米载体平台复合PD-L1siRNA（siPD-L1），用于PD-L1基因沉默介导的肿瘤免疫治疗研究。 在第二章中，我们首先在末端为氨基的G5表面部分修饰甲氧基聚乙二醇，在其内部空腔中包裹金纳米颗粒，并标记荧光胺制备得到了功能化AuDENPs纳米载体。采用各种技术表征其物理化学性质并评价了其体外细胞转染效率。结果显示，所制备的AuDENPs平均粒径为1.9nm、分布均一，具有良好的水溶液分散性和胶体稳定性；和siPD-L1复合后具有良好的细胞相容性和较高的基因传递性能，并有效地沉默B16细胞表面PD-L1蛋白的表达。 在第三章中，通过建立异种移植黑色素瘤小鼠肿瘤模型，我们研究了AuDENPs/siPD-L1复合物的抗肿瘤免疫治疗效果。通过Hamp;E和TUNEL染色实验以及小鼠肿瘤体积变化验证了DENPs/siPD-L1能引起肿瘤细胞的凋亡与坏死，具有抑制肿瘤生长的作用。Westernblot实验、免疫荧光染色及流式细胞仪的实验结果表明，肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达敲除率高达59%，在浸润的肿瘤组织和脾脏中分布大量的CD8+和CD4+T细胞，充分地证实了AuDENPs/siPD-L1复合物可以成功诱导小鼠的免疫响应，且其抑制肿瘤效率及免疫响应都远高于商业来源的PD-L1抗体。 总之，我们成功合成了功能化的AuDENPs，并将其用于基因沉默介导的免疫检查点阻断治疗中。本研究所获得的成果为开发基于树状大分子纳米平台的ICB免疫治疗或ICB/其他治疗的联合治疗提供新思路。
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