摘要
目的：地皮菜（Nostoccommune）是一种固氮蓝藻，多项研究表明蓝藻可以防治肠道炎症，地皮菜活性成分如多糖和水分应激蛋白（waterstressproteins,WSP）也已被证明可用于结肠癌的治疗。这些结果极大的暗示了地皮菜可以缓解溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC），但地皮菜中抗UC的主要活性成分及其作用机制尚不明确。因此，本研究从体内外两方面研究地皮菜对UC的改善作用，旨在明确地皮菜中抗UC的主要活性成分并阐明其可能的分子机制，为其主要活性成分开发成新药奠定基础。方法：收集地皮菜，采用95%乙醇加热回流提取得滤液，经浓缩后得到地皮菜提取浸膏。使用硅胶柱分段纯化提取浸膏，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，乙酸乙酯和甲醇卸柱，薄层色谱法点板合并为A-I段。使用半制备高效液相色谱（HPLC）进行纯化，得到地皮菜提取物A、B、C、D、E、F、G、H、I组分，活性测试发现活性化合物主要在乙酸乙酯卸柱段I，HPLC分析该段大极性部位有一个主要峰。对该峰所在部位（G，H和乙酸乙酯卸柱段I）合并后采用大孔树脂柱纯化，甲醇进行洗脱。将目标化合物合并，使用半制备HPLC进行纯化（25%甲醇+0.1%甲酸），得到单体成分，HPLC分析验证纯度。借助核磁共振碳谱（13C-NMR）、氢谱（1H-NMR）鉴定其结构。为确定地皮菜中抗UC的活性成分，采用动物实验以及细胞实验进一步评价其药效并探讨其机制。在体内，C57BL/6小鼠通过自由饮用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）7天诱导实验性结肠炎，采用疾病活动指数（DAI）评分、髓过氧化物酶（MPO）活性测定、苏木精伊红染色（Hamp;E）、实时荧光定量PCR（Q-PCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法，考察给药剂量为20amp;nbsp;mg/kg，100mg/kg的地皮菜提取物（AENC）、50mg/kg的地皮菜提取物各组分（B、C、D、E、F、G、H、I）、20mg/kg的I组分（前段、后段）、25mg/kg的对羟基苯甲醛（HD）和200mg/kg的阳性对照（美沙拉嗪）对结肠炎小鼠的影响。在体外，MTT法用于检测不同浓度HD和实验浓度脂多糖（LPS）对HT-29细胞活力的影响；将筛选出的HD浓度（1，3和10μM）与1μg/mLLPS联合处理HT-29细胞，同时预设阳性对照组；通过Q-PCR、ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、炎症因子6（IL-6）、炎症因子1-beta（IL-1β）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，以初步探讨地皮菜中主要活性成分HD抗UC的分子机制。结果：（1）AENC（100mg/kg）对DSS诱导的小鼠结肠炎症状的改善作用优于AENC（20mg/kg），且与美沙拉嗪（200mg/kg）效果相当，具体表现为缓解体重减轻，降低DAI评分，改善结肠缩短，下调炎性因子的表达和降低MPO活性。（2）地皮菜提取物B、C、D、E、F、G、H组分（50mg/kg）仅具有微弱的改善作用，而地皮菜提取物I组分（50mg/kg）抗UC作用更显著。（3）地皮菜提取物I组分前段（20mg/kg）对DSS诱导的小鼠结肠炎的改善作用优于地皮菜提取物I组分后段（20mg/kg）。（4）地皮菜提取物I组分前段经结构鉴定为对羟基苯甲醛（HD），HD是地皮菜中抗UC的主要活性成分。（5）HD（25mg/kg）显著抑制DSS诱导的小鼠结肠炎症状，其抗UC的效果优于美沙拉嗪（200mg/kg）。（6）HD（10μM）可显著抑制1μg/mLLPS诱导的HT-29细胞的炎症反应。（7）在动物水平上，HD（25mg/kg）显著上调了DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中E-cadherin的mRNA的表达；在细胞水平上，HD（10μM）显著上调了LPS刺激的HT-29细胞中E-cadherin的mRNA的表达。结论：本研究为地皮菜中抗溃疡性结肠炎的主要活性成分提供了新的见解，除先前文献报道的地皮菜多糖和水分应激蛋白（WSP）外，地皮菜中新发现的活性成分HD可通过下调促炎细胞因子以及上调E-cadherin的表达来修复肠道粘膜损伤，从而发挥抗UC的作用。
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