摘要
背景：随着世界人口老龄化进程的到来，神经退行性疾病的发病率越来越高，已经成为增加人类（尤其是老年人）死亡的重要原因。氧化应激被认为是神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默氏病（Alzheimer''sdisease,AD）等老年变性病发病的主要原因，而且此类人群神经元更易受氧化应激的影响。分泌蛋白和外泌体作为细胞间重要的通讯形式，已有多项研究表明H2O2损伤条件下细胞释放的分泌蛋白和外泌体可以提高受体细胞的氧化耐受性以及抵抗细胞凋亡的能力。但是，氧化应激损伤胁迫下神经元释放的分泌蛋白和外泌体是否参与介导细胞防御机制仍然是未知的。 目的：H2O2作用于小鼠海马神经元HT22细胞诱导建立神经元氧化应激损伤模型，探讨H2O2作用于HT22细胞损伤后蛋白分泌谱的变化；明确H2O2诱导HT22细胞损伤后释放的分泌蛋白和外泌体对正常神经元的影响，以探讨神经元氧化应激损伤级联反应中潜在的分子靶点。 方法：选择100μMH2O2作用于HT22细胞24h，倒置相差显微镜观察细胞形态，CCK-8检测细胞活力，WesternBlot检测细胞凋亡。分别收集两组细胞的条件培养基，超滤管浓缩提取分泌蛋白以及SBI试剂盒提取外泌体。在外泌体鉴定（WesternBlot鉴定CD81表达情况、电镜以及纳米粒径分析）成功的基础上，将分泌蛋白和外泌体分别与正常神经元共培养24h，CCK-8检测细胞活力，WesternBlot检测凋亡相关蛋白Bcl2/Bax以及电压依赖性阴离子通道（Voltage-dependentanionchannel1，VDAC1）蛋白表达水平。双向电泳技术分析H2O2作用下HT22细胞分泌蛋白表达谱的变化，经LC-MS/MS质谱鉴定分析，通过生物信息学方法进行GO和KEGG功能富集。 结果：实验结果显示HT22细胞活力随着H2O2浓度的增加逐渐降低（Plt;0.01），用100μMH2O2作用于HT22细胞24h建立神经元氧化应激损伤模型，可以观察到细胞形态发生明显改变（收缩和凝结），WesternBlot检测凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达下调（Plt;0.01），H2O2可诱导HT22细胞损伤。收集条件培养基，超滤管提取分泌蛋白,双向电泳结合质谱分析表明，H2O2处理HT22amp;nbsp;细胞后释放的分泌蛋白中热休克蛋白90β（HSP90β）表达上调，而蛋白酶体（Psma6）和波形蛋白（Vim）表达下调。同时将所有的差异蛋白进行整合，GO功能注释，发现分泌蛋白主要来源于轴突（GO:0150034）、生长锥（GO:0030426）以及核小体（GO:0000786），而KEGG通路主要富集于内质网中的蛋白质加工（mmu04141）、帕金森病(mmu05012)以及细胞程序性死亡（mmu04217）通路。SBI试剂盒获取外泌体，与分泌蛋白质谱鉴定结果一致的是，WesternBlot结果检测到HSP90β蛋白在外泌体中表达，而且H2O2刺激HT22细胞后释放的外泌体中HSP90β的表达水平更高（Plt;0.05）。将条件分泌蛋白和外泌体分别与HT22细胞共培养后，均显示出细胞活力增强，Bcl-2/Bax表达上调（Plt;0.01），显示出抗凋亡作用，而且外泌体干预组中VDAC1表达下调（Plt;0.05）。 结论：H2O2作用于HT22细胞后释放的分泌蛋白的表达谱发生改变，分泌蛋白大多数来源于轴突、生长锥以及核小体，大部分参与了内质网蛋白的正确折叠、细胞对刺激的反应以及细胞程序性死亡通路。H2O2组的分泌蛋白以及外泌体均表现为HSP90β表达上调，通过促进受体细胞的细胞活力以及抑制细胞凋亡过程发挥神经保护作用。
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