摘要
目的: 探讨RNF2对肝星状细胞活化、增殖的影响及其作用机制，为肝纤维化的治疗方法提供新的靶点和理论依据。 方法： 收集人的正常肝脏样本和纤维化样本，通过HE染色和Masson染色观察其组织病理学改变，同时通过免疫组织化学染色和免疫印迹法检测α-SMA和RNF2的表达变化。用TGF-β1诱导肝星状细胞LX-2，根据RNF2的表达变化选取一个合适的诱导时间和浓度构建体外肝纤维化模型。在LX-2细胞中，通过转染pEGFP-C2-RNF2质粒过表达RNF2，通过感染慢病毒RNF2-shRNA沉默RNF2；并加入TGF-β1诱导，分别用Westernblot和RT-qPCR检测α-SMA、Col1aⅠ、MMP2和TIMP1的表达，ELISA和RT-qPCR检测炎症因子TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌和表达。用MTT方法和EdU染色检测LX-2细胞增殖情况，用流式细胞术检测LX-2细胞凋亡情况。最后通过Westernblot检测RNF2对MAPK信号通路激活的影响。 结果: HE染色和Masson染色结果显示，与正常组样本相比，肝纤维化样本肝小叶结构紊乱，出现严重的肝脏脂肪变性、坏死，并形成再生结节和纤维化间隔。免疫组化和Westernblot的结果提示α-SMA和RNF2在纤维化的肝脏组织中表达明显上调。通过Westernblot结果分析，TGF-β1诱导LX-2细胞后RNF2表达上调，并且在20ng/ml的TGF-β1诱导LX-2细胞24h的条件下，RNF2表达达到峰值，因此我们选取浓度为20ng/ml的TGF-β1诱导LX-2细胞24h作为激活肝星状细胞的条件。我们在分别成功过表达和沉默RNF2的基础上激活肝星状细胞，结果显示RNF2过表达促进α-SMA和Col1aⅠ生成，促进组织金属蛋白酶抑制因子TIMP1表达，抑制基质金属蛋白酶MMP2表达；RNF2过表达能够促进炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β表达和分泌。而RNF2沉默可以逆转上述效应。同时，过表达RNF2促进活化的LX-2细胞增殖，抑制LX-2凋亡；沉默RNF2则抑制LX-2细胞增殖，促进凋亡。Westernblot结果提示，过表达RNF2上调TGF-β1诱导的LX-2细胞的ERK和p38磷酸化水平，沉默RNF2抑制ERK和p38的磷酸化；而RNF2表达变化对JNK磷酸化水平无影响。 结论： 通过以上结果可以得出，RNF2通过调控ERK/p38信号通路促进肝星状细胞的活化、增殖并且抑制其凋亡，促进肝纤维化进展。
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