摘要
研究背景双酚A（BisphenolA,BPA）在工业上作为多种原料的合成单体，大量存在于现代人们日常使用的塑料制品中，是一种目前人类广泛暴露的环境内分泌干扰物（environmentalendocrinedisruptors,EDCs）。随着BPA的生产及使用量的逐年增加，人群通过职业或环境暴露于BPA也日益增多。已有研究显示，环境BPA暴露与肥胖、胰岛素抵抗（insulinresistance,IR）、二型糖尿病（type2diabetes,T2D）等代谢性疾病的发生率呈正相关。动物实验也表明，BPA长期暴露高脂饮食（highfatdiet,HFD）诱导的肥胖小鼠表现为更快速的体重增加和血清胰岛素水平增加、葡萄糖耐量受损、高脂血症、IR等症状，提示BPA促进HFD诱导的小鼠肥胖和IR。肝脏是IR发生过程中机体较敏感的靶器官，长期BPA暴露可能在肥胖发生中导致不可逆的肝脏损伤。肥胖过程伴随肝脏脂肪变性、炎性损伤，严重时导致肝功能异常、肝硬化，最终发展为肝癌。NLRP3炎症小体激活并介导相关炎性因子的分泌是肝脏组织中炎症反应和免疫应答相关研究的关键。但是在BPA促进HFD诱导的IR相关肝脏损伤中，肝脏IL-1β分泌上调是否与NLRP3炎症体激活相关仍然不清，需进一步探讨。 研究目的采用整体动物实验，检测BPA暴露HFD喂养小鼠IR表型、肝脏损伤和肝脏中NLRP3激活及炎症因子IL-1β表达情况，探讨BPA暴露促进HFD诱导的IR相关肝损伤与NLRP3炎症小体激活的关系；并使用NLRP3激活抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体激活，进一步验证NLRP3炎症小体激活在BPA促进HFD诱导的IR相关肝损伤中的调控作用。 研究方法选择3周龄无特定病原体（specificpathogenfree,SPF）雄性野生型C57BL/6J小鼠，共60只。在动物房适应喂养一周后，进行随机分组，共5组，包括NCD组（低脂饲料，正常饮水）、HFD组（高脂饲料，正常饮水），HFD+1000nMBPA暴露组（高脂饲料，BPA饮水暴露）、HFD+NLRP3抑制剂组（高脂饲料，正常饮水）、HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组（高脂饲料，BPA饮水暴露）；每组包括8周和16周两个处理时间，每组每个时间点各有6只小鼠。小鼠经饮水暴露于1000nMBPA。HFD+NLRP3抑制剂组小鼠和HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠分别在第5周到第8周和第13周到第16周每隔一天经腹腔注入10mg/kg的NLRP3激活抑制剂MCC950。每周固定时间称量小鼠体重、饮水量和食物消耗量。在饲养8周和16周结束时从小鼠尾端采血和眼球取血，用小鼠血清检测FG、FI，评定IR；进行GTT和ITT实验；通过AST、ALT实验检测小鼠肝功能。处死小鼠，取肝脏肝大叶中间部分组织，进行组织病理学检测，观察小鼠肝脏组织病理学改变；免疫组化检测肝脏组织中IL-1β、IL-18及TNF-α、NLRP3的表达；免疫荧光检测小鼠肝脏巨噬细胞中NLRP3蛋白表达；WB检测小鼠肝脏组织中IR信号通路的相关蛋白表达、NLRP3炎症小体激活途径中相关蛋白的裂解；qRT-PCR分析小鼠肝脏NLRP3炎症小体激活相关因子IL-1β、ASC、NLRP3和caspase-1mRNA的表达。 结果 1小鼠的一般情况 1.1小鼠饮水和饮食情况 实验期间小鼠状态良好，无死亡等不良现象发生。8周、16周两个时间点的各组小鼠周平均饮水量和食物摄入量的差异均没有统计学意义（Pgt;0.05）。 1.2小鼠体重变化 与NCD组相比，随着小鼠周龄增加，8周、16周时HFD组的小鼠体重都增加，差异有统计学意义（Plt;0.05）；与HFD组相比，HFD+1000nMBPA组小鼠体重增加，从第5周起差异有统计学意义（Plt;0.05）。使用NLRP3抑制剂后小鼠的体重升高被抑制。与HFD组相比，HFD+NLRP3抑制剂组小鼠体重下降，从第7周起差异有统计学意义（Plt;0.05）。与HFD+1000nMBPA组相比，HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠体重明显下降，从第8周起差异有统计学意义（Plt;0.05）。 2小鼠胰岛素抵抗 2.1小鼠FG、FI水平以及HOMA-IR 相比NCD组，8周和16周HFD组小鼠FG、FI水平以及HOMA-IR都升高，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。与HFD组相比，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠FG、FI水平以及HOMA-IR都明显升高，8周和16周HFD+NLRP3抑制剂组小鼠的FG、FI水平以及HOMA-IR都明显下降，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠FG、FI水平以及HOMA-IR都显著降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 2.2小鼠GTT和ITT 对小鼠进行GTT实验，小鼠腹腔注射葡萄糖后，8周和16周小鼠的血糖均快速升高，各组小鼠的血糖水平在第15min时升高到最大浓度，随后逐渐恢复。其中NCD组小鼠的血糖在2h时恢复到初始水平，而HFD组、HFD+1000nMBPA暴露组的小鼠血糖仍比初始水平高。GTT的曲线下面积结果显示，8周和16周HFD组的小鼠曲线下面积高于NCD组（Plt;0.05），HFD+1000nMBPA暴露组的小鼠曲线下面积高于HFD组，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。HFD+NLRP3抑制剂组和HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组的小鼠血糖均在2h时恢复到初始水平。8周和16周HFD+NLRP3抑制剂组的小鼠曲线下面积都明显低于HFD组（Plt;0.05）；8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组的小鼠曲线下面积均比HFD+1000nMBPA暴露组低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 ITT实验中，小鼠腹腔注射胰岛素后，8周和16周小鼠的血糖均快速降低，各组小鼠的血糖水平在第30min时降低到最低浓度，随后逐渐恢复。其中NCD组小鼠的血糖在2h时恢复到初始水平，而HFD组、HFD+1000nMBPA暴露组的小鼠血糖仍比初始水平高。ITT的曲线下面积结果显示，8周和16周HFD组的小鼠曲线下面积高于NCD组，差异具有统计学意义（Plt;0.05），HFD+1000nMBPA暴露组的小鼠曲线下面积高于HFD组（Plt;0.05）。HFD+NLRP3抑制剂组、HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组的小鼠血糖均在2h时恢复到初始水平。8周和16周HFD+NLRP3抑制剂组的小鼠曲线下面积都明显低于HFD组（Plt;0.05）；8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组的小鼠曲线下面积均比HFD+1000nMBPA暴露组低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 3小鼠肝脏损伤 3.1小鼠肝脏系数 相比NCD组，8周和16周HFD组小鼠肝脏组织的脏器系数都明显升高（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠肝脏组织的脏器系数都明显升高（Plt;0.05）。同一处理组在不同时间点之间的比较，16周HFD组和HFD+1000nMBPA暴露组小鼠肝脏组织的脏器系数明显比8周小鼠高（Plt;0.05）。相比HFD组，HFD+NLRP3抑制剂组小鼠在8周肝脏组织的脏器系数无明显差异，而16周脏器系数明显下降（Plt;0.05）。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠肝脏组织的脏器系数都下降，且16周差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 3.2小鼠肝功能 对小鼠进行ALT和AST实验，结果显示，相比NCD组，8周HFD组小鼠AST明显升高（Plt;0.05），ALT无差异，16周HFD组小鼠ALT和AST均升高，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠ALT和AST均升高，且差异具有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，8周HFD+NLRP3抑制剂组小鼠AST显著降低（Plt;0.05），而16周HFD+NLRP3抑制剂组小鼠ALT和AST均显著降低（Plt;0.05）。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠ALT和AST均显著降低，且差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 3.3小鼠肝脏组织病理学改变 小鼠肝脏组织进行组织病理学检测，HE染色结果发现，相比NCD，8周和16周HFD组小鼠的肝脏组织细胞出现轻微的肿胀、大泡样脂肪变性、炎症细胞浸润，并且16周时变化更加明显；相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠肝脏组织细胞排列紊乱，细胞肿胀、大泡样脂肪变性、炎症细胞浸润更严重，并且16周时变化更加明显。相比HFD组，HFD+NLRP3抑制剂组小鼠8周和16周两个处理时间肝脏组织细胞损伤、变性以及浸润程度都降低。而相比HFD+1000nMBPA暴露组，两个处理时间HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠肝脏组织细胞损伤、变性以及浸润程度也都明显降低。 3.4小鼠肝脏组织炎性因子表达 根据IHC观察结果，计算平均累计光密度值（integralopticaldensity,IOD），结果显示，相比NCD组，8周和16周HFD组小鼠肝脏组织的IL-1β、IL-18、TNF-α阳性表达均增加，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠肝脏组织的IL-1β、IL-18、TNF-α阳性表达均增加，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，HFD+NLRP3抑制剂组小鼠肝脏组织的IL-1β、IL-18、TNF-α阳性表达在两个处理时间都显著下降，差异有统计学意义（Plt;0.05）。并且8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠肝脏组织的IL-1β、IL-18、TNF-α阳性表达都显著低于HFD+1000nMBPA暴露组，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。 4小鼠肝脏组织NLRP3炎症小体激活 4.1小鼠肝脏组织NLRP3蛋白表达 免疫荧光检测小鼠肝脏组织巨噬细胞中F4/80和NLRP3表达，结果显示，与NCD组相比，8周和16周HFD组的F4/80和NLRP3表达升高。相比HFD组，8周和16周HFD组的F4/80和NLRP3表达进一步升高。相比HFD组，8周和16周HFD+NLRP3抑制剂组的F4/80和NLRP3蛋白表达降低。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组的F4/80和NLRP3表达也降低。 4.2小鼠肝脏组织NLRP3炎症小体激活相关分子mRNA表达 相比NCD组，8周时HFD组小鼠的肝脏ASCmRNA表达水平升高（Plt;0.05），16周时HFD组小鼠的肝脏NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βmRNA表达水平都升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠的肝脏NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βmRNA表达水平都显著升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，16周时HFD+NLRP3抑制剂组小鼠的肝脏NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βmRNA表达水平都降低，差异有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠的肝脏NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βmRNA表达水平都显著降低，差异有统计学意义（Plt;0.05）。 4.3小鼠肝脏组织中相关蛋白表达 平均灰度值分析结果显示，相比NCD组，8周和16周HFD组小鼠的肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达水平都升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠的肝脏蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β表达水平都显著升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+NLRP3抑制剂组小鼠的肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达水平都降低，差异有统计学意义（Plt;0.05）。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠的肝脏NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达水平都显著降低，差异有统计学意义（Plt;0.05）。 5小鼠肝脏组织胰岛素敏感性检测 IB检测并分析小鼠腹腔注射胰岛素5min后，肝脏组织IRS-1/p-IRS-1（Tyr612）、PI3Kp85/p-PI3Kp85（Tyr458）、AKT/p-AKT（SER473）的表达。结果显示，8周和16周小鼠的肝脏IRS-1、PI3Kp85、AKT的蛋白表达在NCD组、HFD组、HFD+1000nMBPA暴露组之间无明显差异（Pgt;0.05）。相比NCD组，8周和16周HFD组小鼠的肝脏中p-IRS-1、p-PI3Kp85、p-AKT表达水平均下调（Plt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+1000nMBPA暴露组小鼠的肝脏中p-IRS-1、p-PI3Kp85、p-AKT表达水平都下调。8周和16周小鼠的肝脏IRS-1、PI3Kp85、AKT的蛋白表达在HFD+NLRP3抑制剂组、HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组之间无明显差异（Pgt;0.05）。相比HFD组，8周和16周HFD+NLRP3抑制剂组小鼠的肝脏中p-IRS-1、p-PI3Kp85、p-AKT表达水平都升高（Plt;0.05）。相比HFD+1000nMBPA暴露组，8周和16周的HFD+1000nMBPA+NLRP3抑制剂组小鼠肝脏中p-IRS-1、p-PI3Kp85、p-AKT表达都明显升高（Plt;0.05）。 结论 1.BPA暴露促进HFD喂养小鼠IR以及肝脏损伤。 2.BPA暴露通过激活NLRP3炎症小体，上调IL-1β的分泌，加重HFD喂养小鼠IR及相关肝脏损伤。 3.BPA暴露激活的NLRP3炎症小体活化IRS-1/PI3Kp85/AKT信号通路介导IR及相关肝脏损伤。
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