摘要
目的： 了解安徽地区儿童志贺菌血清型分布情况、对抗菌药物的耐药情况和毒力基因，分析志贺菌携带毒力基因与抗药性之间的联系。 材料与方法： 材料：研究样本为安徽省三十四家医院2010年到2015年间从儿童（五岁及以下）粪便中分离的345株志贺菌。选用大肠杆菌ATCC25922作为药敏试验质控菌株，由安徽省细菌耐药中心保存。 方法： 1.对2010年到2015年间儿童（五岁及以下）粪便中分离的345株志贺菌，采用常规生化和VITKE-2Compact全自动微生物分析系统进行细菌的血清型鉴定。 2.选择琼脂稀释法检测345株志贺氏菌对18种抗菌药物的最低抑菌浓度（Minimalinhibitoryconcentration，MIC）。药敏试验的依据是美国临床和实验室标准协会（ClinicalLaboratoryStandardInstitute，CLSI）推荐的标准。 3.检测16种志贺菌毒力基因（VirulenceGenes，VRGs）：ial、ipaC、ipaB、ipaD、ipaA、ipaH、set、sen、sat、virF、virB、icsA、icsB、sigA、pic、sepA。用煮沸法提取志贺菌DNA，通过聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增16对引物，16对引物分成五组分别扩增（组1：ial、ipaH、set、virF；组2：sen、sigA、pic、sepA；组3：icsA、icsB、virB；组4：ipaC、ipaB、ipaD、ipaA；组5：sat）。反应体系为：预混料Taq酶聚合物12.5ul，每种引物的上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，DNA模板2ul，去离子水（ddH2O）6.5ul-9.5ul（使最终反应体系为25ul）；反应条件为：95℃预变性15min；95℃变性45s，退火45s（退火温度：组1为57℃，组2为58℃，组3和组4为60℃，组5为59℃），72℃延伸1min，经过35个循环；72℃延伸10min。取8ulPCR产物在1%琼脂糖凝胶上加样（含0.5ug/ml的EB），电泳条件为电压150V电泳30分钟，通过凝胶成像系统观察并记录实验结果。 结果: 1.分析345株儿童志贺菌临床分离株发现，主要流行的血清亚型是福氏志贺菌（298株，86.4%）。宋内志贺菌是次在流行的血清亚型（44株，12.8%）。在福氏志贺菌中，源于安徽北部区域296株（99.3%），中部区域2株（0.7%）。在宋内志贺菌中，源于安徽北部区域43株（97.7%），中部区域1株（2.3%）。其中，相较于女童而言，福氏志贺菌的感染者多为男童（59.4%：40.6%，Plt;0.0001）。 2.在福氏志贺菌中：耐药性从高到低的前几位分别为氨苄西林（98.3%）、萘啶酸（97%）、四环素（93.3%）、氯霉素（88.6%）和环丙沙星（80.2%）；敏感性从高到低的前几位分别阿米卡星（98.7%）、头孢西丁（94.6%）和哌拉西林/他唑巴坦（93.3%）。在宋内志贺菌中：所有菌株对氨苄西林和阿奇霉素全部耐药（100%）。其次为萘啶酸（97.7%）、庆大霉素（93.2%）、四环素（90.9%）和复方新诺明（88.6%）；所有菌株对阿米卡星全部敏感（100%），其次为哌拉西林/他唑巴坦（97.7%）和亚胺培南（97.7%）。相比而言，福氏志贺菌对环丙沙星、氯霉素的抗药性比宋内志贺菌高；而宋内志贺菌对阿奇霉素、庆大霉素的抗药性比福氏志贺菌高。 3.345株儿童志贺菌临床分离株携带16种毒力基因的情况：（1）在分离的298株福氏志贺菌中：入侵相关基因中ipaH基因检出频率最高，为298株（100%），其次为ipaB基因296株（99.3%），ipaC基因295株（99.0%），ipaD基因295株（99.0%），ipaA基因295株（99.0%）和ial基因288株（96.6%）；肠毒素基因中，set基因283株（95.0%），sen基因278株（93.3%）；调控基因中，icsA基因296株（99.3%），icsB和virB基因检出频率相同，都为293株（98.3%），virF基因288株（96.6%）；SPATEs基因中，sigA基因280株（94.0%），sat基因279株（93.6%），pic基因269株（90.3%），sepA基因267株（89.6%）。（2）在分离的44株宋内志贺菌中：入侵相关基因中，ipaH基因检出频率也是最高，为44株(100%），其次为ipaB基因43株（97.7%），ipaC基因42株（95.5%），ipaD基因41株（93.2%）,ipaA基因41株（93.2%)，最后为ial基因34株（77.3%）；肠毒素基因中，sen基因39株（88.6%），而set基因在此次研究中的宋内志贺菌分离株均未检测到；调控基因中，icsA基因43株（97.7%），virB和icsB基因均为42株（95.5%），virF基因34株（77.3%）；SPATEs基因中，sigA基因43株（97.7%），而sat和pic及sepA基因在研究中的宋内志贺分离株中均未测出。 结论: 1.福氏志贺菌和宋内志贺菌是安徽省儿童志贺菌主要流行血清亚群。北部区域的儿童具有更高的细菌性痢疾感染风险。 2.安徽省儿童临床分离志贺菌一般均为氨苄西林-萘啶酸-四环素的多重耐药株。其中，对于氟喹诺酮类抗菌药物，福氏志贺菌比宋内志贺菌具有更高的抗药性。 3.毒力基因ial、ipaA、ipaC、ipaD、virB、virF、set、icsB、pic、sepA阳性福氏志贺菌比阴性福氏志贺菌对CHL、CIP的抗药性强；set阳性福氏志贺菌比阴性福氏志贺菌对CRO和CAZ的抗药性强；毒力基因ial、virF、set、icsB、virB、pic、sepA阴性福氏志贺菌对GEN和AZM的抗药性更强。毒力基因阳性福氏志贺菌和宋内志贺菌耐药率相似，但对CRO和CAZ的耐药率更高。 4.志贺菌携带数个毒力基因与其抗药性有关。需更进一步分析其表达机制与志贺菌抗药性的遗传问题，由此可以更好的对志贺菌病的临床治疗做出指导。
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