摘要
帕金森病（parkinson’sdisease，PD）是神经退行性疾病中第二常见的。PD标志的病理学改变是路易小体（Lewybody）包裹体形式的α-突触核蛋白（α‐synuclein，α‐syn）在多巴胺（dopamine，DA）能神经元的积累。自噬是一种存在于真核细胞中进化上保守的周转过程，在清除长寿蛋白，聚集蛋白或功能障碍的细胞器时发挥着重要作用。同时，中枢神经炎症与神经退行性疾病有特定的相关性。中枢神经系统炎症和自噬功能障碍参与PD的病理过程已被一系列的研究报道。然而，驱动这些现象的机制仍然不为人所知。鸡豆黄素A（biochaninA，BiochA）是从天然植物中提取的一种异黄酮类雌激素，其具有抗炎、调节糖脂代谢、预防癌症、神经保护等多种生物学功能。本课题组前期的实验已证明BiochA对于神经元有很好的保护作用，但其作用机制目前仍不完全清楚。 目的：明确自噬相关蛋白和NLRP3炎症小体信号在LPS诱导的PD模型小鼠中的变化，以及BiochA的神经保护作用。 方法：1.雄性C57BL/6小鼠40只，随机分为4组：sham组，LPS1d组，LPS3d组和LPS7d组。然后通过脑立体定位注射仪向小鼠黑质部位注射生理盐水或LPS溶液。在造模完成后的第7天开始sham组和LPS7d组的行为学检测。行为学实验完成后，将小鼠处死，取脑组织进行之后的一系列实验。免疫荧光法被用于检测DA能神经元的损伤和FoxO3a、LC3B蛋白的表达变化。WesternBlot法被用于检测自噬相关指标SIRT1，p-FoxO3a/FoxO3a，LC3BⅡ/LC3BⅠ，Beclin1，P62的蛋白表达以及CTSB（cathepsinB，CTSB），NLRP3，Caspase-1和IL-1β的表达情况。 2.雄性C57BL/6小鼠50只，随机被分为5组：sham组、LPS组、LPS+BiochA（16mg/kg）组、LPS+BiochA（32mg/kg）组、LPS+BiochA（64mg/kg）。然后通过脑立体定位注射仪向小鼠黑质部位注射生理盐水或LPS溶液。脑立体定位手术后的第二天，用BiochA（16、32、64mg/kg）分别对相应组别的小鼠进行灌胃，按照0.1ml/10g持续一周。sham组和LPS组给予等量的超纯水。行为学检测在手术后的第7天开始。行为学实验完成后，将小鼠处死，取脑组织进行之后的一系列实验。免疫荧光法被用于检测DA能神经元的损伤和FoxO3a、LC3B蛋白的表达变化。WesternBlot法被用于检测自噬相关指标SIRT1，p-FoxO3a/FoxO3a，LC3BⅡ/LC3BⅠ，Beclin1，P62的蛋白表达以及，CTSB，NLRP3，Caspase-1和IL-1β的表达情况。 结果： 1.自噬相关蛋白和NLRP3炎症小体信号在LPS诱导的PD模型小鼠中的变化 （1）LPS诱导的PD模型小鼠的行为学变化：旷场结果表明，与sham组相比，LPS7d模型组小鼠的总运动长度（m），平均移动速度（m/s），穿线次数和站立次数呈明显的下降趋势。此外，小鼠的抓力实验也表明，与sham组相比，LPS诱导可降低小鼠的抓力。以上行为学结果表明，LPS诱导明显减弱了小鼠的自发活动以及肌肉的收缩能力。 （2）LPS诱导的PD模型小鼠黑质部DA能神经元的损伤情况：sham组的DA能神经元数量多且个体饱满，而LPS模型组的DA能神经元随着造模时间的延长数量逐渐减少，同时形态发生变化，从饱满变得干瘪。 （3）LPS诱导的PD模型小鼠小胶质细胞和DA能神经元的自噬情况：将Iba1和TH分别与LC3B共定位，与sham组相比，模型组TH阳性细胞数量减少且LC3B蛋白增加，同时在TH阳性细胞中可明显观察到LC3B探针的共定位。与sham组相比，虽然模型组小胶质细胞的活化显著增加，但是由于实验手段的局限性难以单一观察小胶质细胞，所以Iba1和LC3B的共定位在动物模型上难以清晰观察。（4）LPS诱导的PD模型小鼠黑质部FoxO3a、Sirt1和p-FoxO3a/FoxO3a比值的变化：免疫荧光结果显示，与sham组相比，LPS诱导增加了FoxO3a蛋白表达。WesternBlot结果显示，与sham组相比，LPS诱导增加了SIRT1蛋白含量，p-FoxO3a/FoxO3a比值显著性降低。 （5）LPS诱导的PD模型小鼠黑质部自噬相关蛋白LC3B,Beclin1,P62的表达变化：免疫荧光结果显示，与sham组相比，LC3B的含量随LPS造模时间的增加而增加。同时，WesternBlot结果显示，与sham组相比，LPS诱导显著增加了LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值以及Beclin1，P62的蛋白表达水平。 （6）LPS诱导的PD模型小鼠黑质部CTSB、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达变化：WesternBlot结果显示，与sham组相比，随着LPS造模时间的增加小鼠黑质部CTSB、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达均不同程度的增加。 2.BiochA对LPS诱导的PD模型小鼠的保护作用及其机制研究 （1）BiochA对LPS诱导的PD模型小鼠行为学的影响：旷场实验数据表明，与LPS模型组相比，BiochA治疗后小鼠的总运动长度（m），平均移动速度（m/s），穿线次数和站立次数均不同程度的提高。此外，小鼠抓力实验也表明，BiochA给药组与LPS模型组相比较，小鼠抓力明显增加。上述行为学结果提示，BiochA能够明显改善LPS诱导的小鼠行为障碍。 （2）BiochA对LPS诱导的PD模型小鼠黑质部DA能神经元的影响：免疫荧光结果提示，BiochA治疗可以发挥神经保护作用，能明显减轻LPS诱导的DA能神经元损伤。 （3）BiochA对LPS诱导的PD模型小鼠黑质部FoxO3a、Sirt1和p-FoxO3a/FoxO3a比值的影响：免疫荧光结果显示，与LPS模型组相比，给予不同剂量的BiochA治疗均降低了FoxO3a蛋白表达。WesternBlot结果显示，与LPS组相比，BiochA组SIRT1蛋白含量减少，p-FoxO3a/FoxO3a比值增加。 （4）LPS诱导的PD模型小鼠黑质部自噬相关蛋白LC3B,Beclin1,P62的表达变化：免疫荧光结果显示，与LPS模型组相比，BiochA组LC3B的蛋白含量显著降低。同时，WesternBlot结果显示，与LPS模型组相比，BiochA治疗降低了LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值以及Beclin1，P62的蛋白表达水平。 （5）BiochA对LPS诱导的PD模型小鼠黑质部CTSB、NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达的影响：WesternBlot结果显示，与LPS模型组相比，BiochA组小鼠黑质部CTSB、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达均不同程度的降低。 结论： 1.LPS诱导DA能神经元损伤，可能与自噬溶酶体功能障碍释放的CTSB激活NLRP3炎症小体有关。 2.BiochA可能通过缓解自噬溶酶体功能障碍，减轻溶酶体损伤释放的CTSB和NLRP3炎症小体的激活从而发挥DA能神经元的保护作用。
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