摘要
背景： 肝细胞癌(Hepaticcarcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率极高，五年生存率仅为51％[1]。由于肝癌的早期转移、复发、毒性、耐药等原因，肝癌的治疗至今仍是大难题。近年来，随着人们对肿瘤流行病学、病原学、免疫学、遗传学等诸多领域认识的加深，生物治疗，即肿瘤免疫治疗的重要性越来越受到人们的关注。研究表明，肿瘤微环境是一种复杂的生态环境，它包含着决定肿瘤细胞恶性程度的重要因素。在肿瘤微环境中，多种免疫细胞参与调节，巨噬细胞(Macrophage，Mφ)在肿瘤发展的各个阶段都大量存在，并发挥着重要作用，被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages，TAMs)。刚地弓形虫是一种机会性致病的细胞内寄生原虫,包括Ⅰ型虫株(RH株,GT1株等),Ⅱ型虫株(PRU株,ME49株等),和Ⅲ型虫株(CTG菌株等)。弓形虫速殖子的顶端有复杂的细胞结构和分泌细胞器，能够分泌多种效应蛋白，主要包括微线体蛋白(MIC)、棒状体蛋白(ROP)和致密颗粒蛋白(GRA)。在抗弓形虫感染过程中，细胞免疫起主导作用，Mφ是主要效应细胞之一。弓形虫效应分子GRA15Ⅱ能够驱动Mφ向M1偏移，发挥Th1型免疫反应。如果改变TAMs的极化方向，使M2型转化为M1型，对抗肿瘤增殖、侵袭和转移意义非常。 目的： 观察和分析GRA15Ⅱ在肿瘤微环境中对TAMs的影响，进一步探究其抑制肿瘤增殖的机制，为肿瘤免疫治疗提供新的思路。 方法： 利用实时PCR（realtime-PCR）法在速殖子总RNA中扩增编码TgGRA15II，构建重组慢病毒(LV)载体(LV-pEGFP-gra15II)；通过腹腔注射脂质体氯膦酸盐耗竭小鼠体内巨噬细胞，右下腹股沟皮下注射含3×106个hepa1-6的生理盐水构建小鼠肿瘤模型，尾静脉注射LV-gra15Ⅱ感染小鼠；通过实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR,QPCR)和免疫印迹(Westernblotting,WB)证明LV-gra15Ⅱ成功接种到小鼠体内，测定TNF-α,IL-12,IL-10,和Arginase1(Arg1)的相对表达；ELISA测定TNF-α,IL-12,IL-10,和Arg1表达情况；通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)观察巨噬细胞数量，检测IFN-γ、IL-10、TNF-α、VEGF表达，进一步对肿瘤微环境中免疫应答进行分析；流式细胞术检测巨噬细胞表型；细胞免疫荧光（Immunofluorescence）检测GRA15Ⅱ和p65在TAMs的表达情况。 结果： （1）第一部分：第一部分：与Liposome-PBS组小鼠组织的gra15ⅡmRNA表达水平相比，Liposome-PBS+LV-gra15Ⅱ和Liposome-clodronate+LV-gra15Ⅱ组的表达与PBS组相比差异十分显著；在蛋白水平上，GRA15Ⅱ在Liposome-PBS组中不存在条带，而Liposome-PBS+LV-gra15Ⅱ和Liposome-clodronate+LV-gra15Ⅱ组条带显著，且与PBS组相比差异有显著性，说明LV-pEGFP-gra15II载体在小鼠体内成功表达。Liposome-PBS组肿瘤大小与Liposome-clodronate+LV-gra15Ⅱ组肿瘤大小差异无显著性，而Liposome-PBS+LV-gra15Ⅱ组肿瘤体积显著减小。免疫组化结果显示，Liposome-PBS组、Liposome-PBS+LV-gra15Ⅱ和Liposome-clodronate+LV-gra15Ⅱ组组织经过F4/80染色，Liposome-PBS组和Liposome-PBS+LV-gra15Ⅱ阳性率与Liposome-clodronate+LV-gra15Ⅱ相比差异具有显著性，Liposome-clodronate+LV-gra15Ⅱ的阳性率极低，即clodronate成功清除了巨噬细胞。综上，LV-gra15Ⅱ主要通过巨噬细胞发挥抑制肿瘤生长的能力。（2）第二部分：LV-gra15Ⅱ直接转染RAW264.7后，巨噬细胞向M1极化偏移；事先处理RAW264.7诱导为M2型，再转染LV-gra15Ⅱ，能够将从M2向M1型偏移，对事先诱导的M1型RAW264.7无影响。Vehicle和LV-vector组的Arg1、IL-10的相对表达无差异，而LV-gra15Ⅱ组与前两者相比，mRNA的表达显著下降；同时，Vehicle和LV-vector组IL-12和TNF-α无差异，LV-gra15Ⅱ组的mRNA水平显著升高。ELISA结果显示NO和IL-12在Vehicle和LV-vector组分泌差异不显著，而在LV-gra15Ⅱ组中显著升高，IL-10的分泌显著下降。免疫组化结果显示LV-gra15Ⅱ组的IFN-γ和TNF-α的阳性率显著高于Vehicle和LV-vector组，而IL-10和VEGF的阳性率显著低于Vehicle和LV-vector组。 （3）第三部分：流式结果显示LPS和IFN-γ诱导巨噬细胞向M1偏移，LV-gra15Ⅱ不会影响巨噬细胞向M1的偏移，而IL-10和IL-13可以诱导巨噬细胞向M2极化，LV-gra15Ⅱ可使得M2型巨噬细胞逆转为M1型。qPCR显示，M1型巨噬细胞的LV-vector和LV-gra15Ⅱ组的IL-12和TNF-α的表达无差异，LV-gra15Ⅱ对M1型和M2型巨噬细胞的IL-12和TNF-α的表达无显著影响，而LV-gra15Ⅱ会使M2型巨噬细胞的IL-12和TNF-α的表达显著升高，Arg1和IL-10的趋势与其相反，即LV-gra15Ⅱ会使M2型巨噬细胞的Arg1和IL-10表达显著降低。ELISA显示，M1型的LV-vector和LV-gra15组IL-10分泌无明显差异，而LV-gra15Ⅱ与LV-vector相比，IL-10分泌显著下降；IL-12和NO的变化趋势与IL-10相反，即LV-gra15Ⅱ使IL-12和NO在M2型巨噬细胞中显著下降。 （4）第四部分：WB结果显示：检测到GRA15Ⅱ蛋白作为成功感染的对照，未感染的细胞（未用TNF-α刺激或未用TNF-α刺激）作为NF-κB活化的对照。观察到在感染的细胞中磷酸化的IKKβ水平更高。对IκBα和p65磷酸化的分析还显示，与LV-gra15Ⅱ，LV-vector或对照Mφ相比，对照中的磷酸化水平更高。另外，GRA15Ⅱ在TRAF6-/-Mφ中不能诱导其磷酸化。Liposome-PBS组和Liposome-PBS的p65正常处于胞质，LV-gra15Ⅱ则会使p65转移到核内。 结论： 弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ通过TRAF6-NF-кB途径逆转TAMs从M2型向M1型偏移，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，为肿瘤治疗提供了新思路。
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