摘要
胃癌(GastricCancer，GC)作为消化系统癌症常见种类之一，有着高发病率和高死亡率的特点，2020年中国胃癌发病及死亡例数占癌症总发病例数、死亡例数第三位，严重威胁人类健康。胃癌在初期发病有较强隐藏性，多数患者确诊时已是中晚期，这使胃癌治疗成为临床难题。胃癌发病机制错综复杂，可涉及到细胞增殖异常和细胞凋亡异常，正常的细胞凋亡对稳定胃部内环境起到至关重要的作用，一旦细胞凋亡程序失调，癌细胞不受控制发生增殖，可能是胃癌发生、发展的关键因素，因此细胞凋亡也成为了探究胃癌发病机制中的研究热点。近年来对白细胞介素家族的研究发现，该家族成员可通过调节细胞增殖与凋亡、推动肿瘤细胞侵袭、转移等过程参与肿瘤进展。白细胞介素-32(Interleukin-32，IL-32)有促炎特性，不仅与炎症性疾病有关，而且与胃癌的发生、发展紧密相连。凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1，Apaf-1)是细胞凋亡的激活剂，在细胞凋亡途径中以关键的促凋亡调节因子身份参与肿瘤进程，其表达水平改变对细胞凋亡有着重要的调节作用。目前IL-32调控胃癌细胞凋亡的研究未见报道，其调控机制也不明确，是否与Apaf-1的参与有关均未见文献报道。因此本课题采用免疫组化SP法、WB、qRT-PCR、AnnexinV-FICT/PI染色等实验方法，研究IL-32是否通过调控Apaf-1影响胃癌细胞的凋亡，分析在胃癌中两因子间存在的关联，为胃癌的分子诊断提供理论依据，为靶向精准治疗开辟新途径。 目的： 探讨IL-32与Apaf-1在胃癌组织中的表达情况，分析二者在胃癌中的相关性，初步阐明IL-32可能通过调控Apaf-1表达改变抑制胃癌细胞凋亡，为胃癌临床诊断及精准治疗提供新方向。 方法： 1收集临床60例新鲜组织样本，每例样本包含胃癌组织及同期相对应的正常胃黏膜上皮组织。为了确定IL-32、Apaf-1在60例新鲜组织样本中的表达水平，分别采用免疫组化SP法、WB技术研究蛋白水平上的 表达变化，采用qRT-PCR技术研究在基因水平上的表达改变。在蛋白和基因水平上分析二者表达存在的相关性及与临床病理特征间的关系。 2体外培养人胃癌细胞MGC-803，RNA干扰技术改变IL-32的表达，转染靶向阴性核苷酸序列siRNA、IL-32siRNA至MGC-803细胞中构建阴性对照组(NC)以及转染组(si-IL-32)。为确保转染组细胞构建成功，转染48小时后分别采用WB和qRT-PCR技术对转染效率进行双重鉴定。确定si-IL-32组细胞构建成功后，采用AnnexinV-FICT/PI染色法检测si-IL-32组和NC组细胞凋亡的情况。 3采用WB技术检测si-IL-32组和NC组中Apaf-1蛋白及其下游通路相关蛋白cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表达变化。 结果： 1IL-32、Apaf-1在胃癌和癌旁正常胃黏膜组织的表达情况 1.1免疫组化SP法检测结果：IL-32蛋白和Apaf-1蛋白在胃癌组织阳性表达率分别为70.0%、31.7%；在癌旁正常胃黏膜组织阳性表达率分别为38.3%、75.0%。与癌旁正常胃黏膜组织相比，胃癌组织IL-32蛋白阳性表达率更高(P＜0.05)，而Apaf-1结果相反，蛋白阳性表达率明显降低(P＜0.05)。 1.2WB检测结果：胃癌组织中IL-32、Apaf-1蛋白相对表达量分别与正常胃黏膜组织中蛋白相对表达量做比较发现，IL-32蛋白相对表达量明显增多(P＜0.05)，而Apaf-1结果相反，蛋白相对表达量减少(P＜0.05)。 1.3qRT-PCR检测结果：胃癌组织中IL-32、Apaf-1mRNA相对表达量分别与正常胃黏膜组织中mRNA相对表达量比较发现，IL-32mRNA相对表达量增加(P＜0.05)，而Apaf-1结果相反，mRNA相对表达量明显减少(P＜0.05)。 1.4IL-32、Apaf-1与胃癌患者临床病理特征的关系 不论在蛋白水平还是基因水平上的检测结果都表明，胃癌组织中IL-32、Apaf-1的表达不受患者性别、年龄影响(P均＞0.05)；受肿瘤组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期影响(P均＜0.05)。 1.5IL-32与Apaf-1在胃癌中相关性研究 相关性分析显示，不论在蛋白水平还是基因水平，胃癌组织中IL-32和Apaf-1表达存在负相关关系(P＜0.05)。 2IL-32抑制胃癌细胞MGC-803凋亡 2.1鉴定转染效率：经WB及qRT-PCR技术验证，si-IL-32组与NC组相比明显干扰IL-32表达下降(P均＜0.05)，证明si-IL-32组细胞构建成功。 2.2检测细胞凋亡率：AnnexinV-FICT/PI染色法检测IL-32低表达的MGC-803细胞，si-IL-32组与NC组相比可以发现，细胞凋亡率显著增加(P＜0.05)。 3转染IL-32对Apaf-1表达及其下游通路相关分子的影响 3.1经WB技术验证，si-IL-32组与NC组相比发现，MGC-803细胞中Apaf-1表达量增多(P＜0.05)、其下游通路相关蛋白cleaved-caspase9、cleaved-caspase3表达水平均有显著增加(P均＜0.05)。由此推出敲低细胞中IL-32的表达可使Apaf-1及其下游通路相关蛋白表达发生改变。 结论： 1IL-32和Apaf-1均参与了胃癌的发生、发展。 2IL-32与Apaf-1表达在胃癌中具有负相关关系。 3IL-32抑制胃癌细胞MGC-803凋亡，可能是通过调控Apaf-1实现。
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