摘要
昆虫杆状病毒因其宿主特异性，不感染人和其他脊椎动物的特点，近年来越来越多地应用于环境友好型生物杀虫剂的研发，以期防治虫害。随着大气环境的污染，紫外线辐射日益加剧。紫外线辐射能使DNA相邻碱基共价结合，产生环丁烷嘧啶二聚体（CPD）。生物杀虫剂投放后，病毒DNA易受到紫外线损伤引起毒力下降进而减弱了杀虫效果。有研究表明，在太阳光下连续照射24小时后，杆状病毒将丧失大部分活性。 核苷酸切除修复过程中的核酸内切酶能特异性切割嘧啶二聚体的5＇端糖苷键，修复紫外线引起的DNA损伤。本课题组前期研究发现，家蚕核型多角体病毒蛋白Bm65具有GIY-YIG核酸内切酶超家族保守结构域，预测在紫外线损伤修复过程中发挥作用。本论文通过表达纯化Bm65蛋白，进而体外验证了Bm65具有核酸内切酶活性，能特异性切割紫外线诱导的DNA损伤。同时，鉴定了GIY-YIG结构域为该蛋白的关键功能序列，并且通过研究与Bm65蛋白相互作用的宿主蛋白BmRPL13来探讨在紫外线损伤修复过程中病毒与宿主的相互影响。本论文的主要研究结果如下： 1.Bm65蛋白具有核酸内切酶活性。原核表达纯化Bm65蛋白并进行核酸内切酶活性测定，发现Bm65蛋白能特异性切割紫外线诱导的DNA损伤。 2.Bm65蛋白的关键功能域为GIY-YIG结构域。构建Bm65的截短突变体并进行原核表达纯化及核酸内切酶活性测定，发现Bm65（1-36AA）即GIY-YIG结构域主要发挥核酸内切酶活性功能。表达Bm65（1-36AA）的大肠杆菌较空载对照组对紫外线具有更强的抵抗力，同时实验结果表明截短突变体与Bm65蛋白全长相比因缺失了部分基因序列，酶切效果减弱。 3.Bm65蛋白与宿主蛋白BmRPL13相互作用。（1）原核表达纯化BmRPL13蛋白进行Pull-down体外验证了Bm65蛋白与BmRPL13蛋白直接相互作用。（2）构建带mcherry荧光报告基因的BmRPL13载体，转染细胞进行亚细胞定位分析，结果发现BmRPL13与Bm65在细胞核内进行共定位。（3）紫外线诱导宿主细胞产生DNA损伤，免疫荧光实验进一步发现BmRPL13与Bm65能共定位于紫外线诱导的DNA损伤处。（4）BmRPL13蛋白增强紫外线辐射后大肠杆菌的存活率。表达BmRPL13的大肠杆菌较空载对照组对紫外线具有更强的抵抗力。 目前，除了在少数几种杆状病毒中发现与紫外线引起的DNA损伤修复相关的光修复酶外，绝大多数杆状病毒通过什么途径，利用哪些蛋白来修复UV引起的损伤尚不清楚。本研究证明家蚕核型多角体病毒蛋白Bm65为核酸内切酶，能特异性切割紫外线诱导的DNA，推测杆状病毒中可能存在核酸切除修复途径。
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