摘要
阿尔茨海默症（Alzheimer’sDisease,AD）是以逐渐进展的记忆、认知功能减退为主要临床特征的神经退行性疾病。脑内出现β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积及神经元发生凋亡被认为是AD发病的决定因素。研究显示，AD脑内存在神经元细胞周期再进入以及细胞周期病理学反常现象，FoxG1作为端脑发育过程中的重要转录因子，在AD中的作用及其机制国内外鲜见报道。在本研究，我们发现1）AD的发生伴随FoxG1表达下调，细胞周期抑制因子P21表达上调，且FoxG1具有拮抗P21的作用；2）FoxG1能够减轻AD小鼠Aβ沉积以及神经元凋亡，改善AD小鼠行为学缺陷；3）FoxG1通过靶控神经元细胞周期，减少AD神经元细胞周期再进入、减少细胞G2/M期阻滞以及改善AD细胞周期病理学反常从而改善AD的发生。因此，FoxG1很可能成为AD治疗、干预的新靶点。 研究目的 （1）AD发生的病理过程中，FoxG1和细胞周期蛋白P21的变化。 （2）FoxG1与P21之间的作用关系。 （3）探究FoxG1能否改善AD发生。 （4）探究FoxG1是否通过调控神经元细胞周期的再进入及细胞周期进程改善AD的发生。 研究方法 （1）探究FoxG1和细胞周期蛋白P21在AD发生中的作用：①AD转基因小鼠模型和AD细胞模型的构建及验证：选择（2月龄、6月龄）APP/PS1小鼠为模型动物：运用分子生物学和各种小鼠行为学技术（NOR、NPR、PPI和MWM）验证AD模型小鼠的表观有效性（记忆、认知、感觉信息门控）及机理有效性（Aβ沉积及凋亡参数）；N2A细胞系脂质体转染APPswe质粒，Westernblotting检测Aβ表达，构建AD体外模型。②Westernblotting和免疫组织化学技术检测P21与FoxG1在AD体内、外模型的表达。③流式和免疫印迹实验检测P21是否诱导凋亡。 （2）FoxG1与P21之间的关系：引入CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFPamp;nbsp;（FoxG1fl/fl）转基因小鼠，皮层注射rAAV2/9-CMV-Cre-WPRE-pA（Cre-AAV），通过Cre/LoxP基因重组技术获得FoxG1过表达小鼠（FoxG1fl/fl+Cre-AAV），检测P21表达。HEK293T细胞系脂质体转染FoxG1和P21质粒，CO-IP验证二者之间的蛋白互作。 （3）探究FoxG1能否改善AD发生：构建AD病变脑区FoxG1皮层过表达小鼠（AD/FoxG1fl/fl+Cre-AAV），AD与FoxG1fl/fl小鼠杂交获得AD/FoxG1fl/fl，在AD/FoxG1fl/fl皮层注射Cre-AAV。①检测FoxG1对AD病理学标记物Aβ沉积的影响。②运用NOR、PPI和MWM实验评价FoxG1对AD样行为的干预效果。 （4）探究FoxG1是否通过调控神经元细胞周期的再进入及细胞周期进程模式改善AD发生：①评估FoxG1、P21及P21活化激酶PAK3的表达；免疫组化技术检测各周期标记蛋白表达，评价FoxG1对AD神经元细胞周期进程模式的调控；免疫荧光检测Bcl2和BAX表达，评价凋亡指标。②N2A细胞系过表达FoxG1、APPswe、APPswe+FoxG1，通过流式细胞术评估FoxG1对G0/1、S和G2/M期细胞周期分布的调控。 研究结果 （1）①APP/PS1（6月龄）转基因小鼠能够明显模拟阿尔茨海默症表观有效性：短期适应能力不足、空间记忆及学习能力障碍，感觉信息门控受损。机理有效性：Aβ沉积及细胞凋亡明显增加；6月龄APP/PS1小鼠脑区BAX升高，Bcl2下降，抗凋亡指数Bcl2/BAX下降。②AD体内、外模型显示P21表达上调，FoxG1表达下调。③N2A细胞系过表达P21，流式细胞术结果显示P21诱导凋亡增加。 （2）以FoxG1fl/fl+Cre-AAV小鼠为研究对象，发现FoxG1皮层过表达能够明显抑制P21的水平，CO-IP实验证实FoxG1与P21存在负向调控关系。 （3）AD病变脑区FoxG1皮层过表达小鼠为研究对象，发现FoxG1过表达减少Aβ沉积。新物体识别/新位置识别实验表明FoxG1过表达改善AD小鼠短期适应能力不足；水迷宫实验显示FoxG1过表达缓解AD小鼠空间记忆及学习能力障碍；前脉冲抑制实验显示FoxG1能够改善AD小鼠的感觉信息门控障碍。 （4）AD体内、外模型显示AD神经元可通过G1/S检查点，但阻滞在G2/M期。FoxG1通过①拮抗P21及P21激酶PAK3的表达抑制细胞周期的再进入，②负向调控细胞周期异常标记蛋白的表达，减少AD细胞周期G2/M期的阻滞进而减少细胞凋亡及AD病理学反常。 研究结论 AD发生伴随FoxG1表达下调；FoxG1减轻AD小鼠Aβ沉积以及神经元凋亡，改善AD小鼠行为学缺陷；FoxG1通过拮抗P21以及其他周期蛋白参与靶控神经元细胞周期，减少AD神经元细胞周期反常进入以及减少G2/M期阻滞改善AD的发生。因此，FoxG1对于改善AD的发生可能是一个很好的潜在的靶点。
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