摘要
鸡内金是常见的药食两用中药，来源于雉科动物家鸡GallusgallusdomesticusBrisson的干燥沙囊内壁，用于治疗呕吐、小儿积食、腹泻、遗尿、遗精、胆道忧郁症等疾病，历版《中国药典》都有收载，同时鸡内金还作为保健食品被广泛应用，其市场需求量较大，因此出现了大量的替代、掺假现象，甚至掺杂了部分病鸡源的内金，严重影响了用药安全。鸡内金中主要成分为氨基酸、蛋白质、多糖等，植物源中药饮片常用的小分子检测技术难以发挥作用；而2020年版《中国药典》一部中对鸡内金的质量评价还依赖于传统的性状鉴别，缺乏专属性强的手段。本论文通过电子鼻和PCR建立鸡内金的质量评价关键技术，以期实现对鸡内金伪品、掺伪品、病原微生物等的鉴别，并为中成药中鸡内金的真伪检识提供手段。 本论文研究内容主要包括： 1.建立了通过电子鼻检测以鉴别鸡内金的技术，提升性状鉴定可靠性。传统性状鉴定主要以外形、色泽、断面、气味等作为依据，依靠鉴定者望、闻、尝等办法，较为主观，并且高度依赖鉴定者经验。本部分研究优化并建立了电子鼻测定技术，将鸡内金粉末的挥发性气味进行量化，并揭示鸡内金与其伪品以及鸡内金生品与其炮制品的差异，继而通过统计分析达到真伪鉴定及鉴别饮片形式的目的。在优化的检测条件下，采用电子鼻技术并结合统计分析判别14批市售鸡内金均为真品，未鉴别出伪品和掺伪品，并且实现了鸡内金和炒鸡内金的准确鉴别。本章结果表明，电子鼻技术可以有效提升鸡内金性状鉴定可靠性。 2.建立多重PCR鉴定鸡内金的技术，实现掺伪品鉴别。在鸡内金药材收集过程中，经常有意或无意地掺入鸭内金和鹅内金，由于其外形较为相似，且化学组成接近，常规的光谱及色谱分析难以对掺伪品进行检识。在本部分研究中，基于物种特异性引物扩增建立了多重PCR方法，以用于同时检测鸡内金及其伪品基原DNA，并进行方法学验证，从而实现鸡内金及其掺伪品的鉴别。首先优化了PCR方法的反应体系、反应条件，然后考察了本方法的灵敏度、专属性和适用性；所建立的检测方法具有较高的特异性，检测限为1ng/μL，并从人工混合样品中准备鉴别出了鸭内金和鹅内金。通过所建立的关键技术，从14批市售生鸡内金和炒鸡内金商品中鉴定出2批混入鹅内金的掺伪品。结果表明，本章建立的多重PCR技术可以实现鸡内金饮片的掺伪鉴定。 3.建立多重PCR鉴定中成药中鸡内金真伪的技术。中成药是由饮片粉碎或者提取后制成的中药制剂形式，由于其为多种中药及辅料的混合物，难以通过性状鉴别、显微鉴别进行其中所含中药成分的真伪鉴定。本部分研究基于以上物种特异性多重PCR技术，优化了PCR方法的反应体系、反应条件，并考察了所建立方法的灵敏度和特异性；结果表明，所建立的检测方法具有较高的特异性，检测限为1ng/μL。采用所建立的关键检测技术，从临床常用中成药“小儿复方鸡内金散”和“小儿肺咳颗粒”中分别鉴定出2批混有鸭内金的掺伪品和1批混有鹅内金的掺伪品。结果表明，本章建立的多重PCR技术可以实现中成药中鸡内金的掺伪鉴定。 4.建立荧光定量PCR检测鸡内金中大肠埃希菌污染程度的技术。2020年版《中国药典》四部中规定中药饮片不得检出大肠埃希菌。中药饮片附着微生物种类多但是数量少，提取得到的DNA量极微，普通的PCR技术灵敏度较低。本部分研究设计并优化了荧光定量PCR方法，将扩增信号放大，从14批市售鸡内金饮片中均检测出了大肠埃希菌，检测结果与常规PCR和平板培养计数结果进行比较，展现了较高的灵敏度和准确性。
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