摘要
拟穴青蟹是我国青蟹养殖的优势品种，具有较高的经济价值。拟穴青蟹呼肠孤病毒(MCRV)是拟穴青蟹致死率较高的一种病毒，对青蟹的养殖业产生较大的影响。因此，研究拟穴青蟹呼肠孤病毒的快速诊断及其致病机制具有重要意义。本文从拟穴青蟹呼肠孤病毒的致病性出发，一方面结合现有的诊断技术，针对拟穴青蟹呼肠孤病毒构建一种能够在养殖现场进行应用的实时、便捷、灵敏、快速的诊断技术体系；另一方面以拟穴青蟹呼肠孤病毒VP6基因为研究对象，分析其生物学特性。探究拟穴青蟹呼肠孤病毒的致病机理，为青蟹病害防控与抗病育种提供研究基础。本文研究结果共计分为4个部分，如下所示。 （1）针对拟穴青蟹呼肠孤病毒VP6基因，设计4条特异性引物、2条环引物和1条探针，将环介导等温扩增检测手段与侧向流层析试纸结合，优化各反应条件及反应试剂浓度，构建针对MCRV的RT-LAMP-LFD快速诊断技术体系。MCRV-LAMP-LFD整个诊断过程最快能够在20min内完成，其灵敏度能够达到10pg级别，比常规PCR检测高10倍。 （2）对拟穴青蟹呼肠孤病毒VP6基因进行生物信息学分析。利用Primer5.0设计带有BamHI和HindIII酶切位点的一对特异性引物，PCR扩增MCRV-VP6编码序列，经测序比对鉴定，构建重组质粒pMD18T-VP6。双酶切后回收VP6片段，并将其克隆到载体pET28a(+)上，构建重组质粒pET28a-VP6，再将其转化至E.coliDH5α感受态细胞之中。通过PCR和双酶切实验进行筛选，最终获得转染有pET28a-VP6重组质粒的阳性克隆菌株。 （3）将重组质粒pET28a-VP6转化至E.coliBL21感受态细胞之中。通过PCR和双酶切实验进行筛选，最终获得转染有pET28a-VP6重组质粒的阳性表达菌株。IPTG诱导表达VP6重组蛋白，经验证VP6重组蛋白以包涵体的形式存在。Ni柱纯化的方法获得VP6纯化蛋白，免疫兔子制备VP6重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA实验测定VP6多克隆抗体效价为1:512000，Westernblot实验表明VP6多克隆抗体与靶蛋白产生特异性杂交，表明制备的VP6多克隆抗体效价高且特异性强。 （4）通过组织病理学、显微超薄切片、实时荧光定量PCR和Westernblot等实验技术，系统的分析MCRV在拟穴青蟹各组织中的转录和表达情况。研究表明，拟穴青蟹感染呼肠孤病毒时，在其体内的各个组织中均检测到MCRV的存在，表明MCRV的组织嗜性较广泛，特别是在鳃、肌肉和完整肠道组织中的相对表达量较高。病理学观察结果分析，MCRV侵染会严重破坏拟穴青蟹组织细胞结构致其发生明显的病理变化。
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