摘要
研究背景 泌尿生殖道沙眼衣原体感染是全世界最常见的性传播疾病之一，绝大多数感染者无症状，但未经治疗可导致严重的并发症，如引起男性前列腺炎、女性盆腔炎和不孕症。抗生素是目前主要的治疗方法，然而随着抗生素耐药风险的逐年增加，临床上沙眼衣原体感染治疗失败的报道越来越多。因此，亟需开发新的治疗沙眼衣原体感染的方法。我们课题组前期发现大黄酸具有抑制沙眼衣原体生长的作用，但大黄酸对沙眼衣原体生长过程的影响及其作用机制，目前国内外文献未见报道。本研究将通过细胞感染模型和动物感染模型探讨大黄酸对沙眼衣原体生长的抑制作用，并应用RNA-seq转录组分析，初步探讨大黄酸对沙眼衣原体的作用机制。 研究目的 1.从细胞水平明确大黄酸对沙眼衣原体感染的作用。 2.从小鼠感染模型阐述大黄酸对沙眼衣原体感染的作用。 3.应用RNA-seq初步探讨大黄酸对沙眼衣原体感染的潜在作用机制。 研究方法 1.采用细胞计数CCK8法确定大黄酸细胞水平上的药物作用浓度。应用免疫荧光染色、子代感染效价、免疫印迹实验和透射电镜技术，观察大黄酸处理后对4种血清型沙眼衣原体（D，E，F，L1）感染的作用以及其在不同细胞系中对沙眼衣原体感染的作用。 2.建立沙眼衣原体感染Balb/c小鼠模型，探讨大黄酸在体内的抗沙眼衣原体作用。 3.在不同感染阶段使用大黄酸处理沙眼衣原体，探讨大黄酸在沙眼衣原体感染周期中潜在的作用途径。 4.通过RNA-seq技术分析阳性对照组与大黄酸处理组基因表达，对差异基因集进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，经逆转录实时荧光定量PCR检测其mRNA表达改变,经免疫蛋白印迹检测蛋白表达改变。 研究结果 1.在细胞水平中，四种不同血清型沙眼衣原体（D、E、F、L1）感染HeLa、McCoy和Vero细胞后，大黄酸处理组较对照组沙眼衣原体感染率、包涵体面积、子代效价均明显降低；48h透射电镜阳性对照组包涵体大且充满大量成熟原体，而大黄酸处理组包涵体小且存在少量始体；大黄酸的抑制作用具有剂量效应和时间效应，且与阿奇霉素有联合作用。 2.在小鼠感染模型中，小鼠阴道拭子衣原体培养滴度显示大黄酸与阿奇霉素联合作用3天与作用7天均与阳性对照组有统计学差异，大黄酸单独作用3天和阿奇霉素单独作用3天与阳性对照组无统计学差异，阿奇霉素单独作用7天与阳性对照组有统计学差异。 3.大黄酸和沙眼衣原体在体外分别共孵育12、24、36、48小时后感染细胞，衣原体的感染率、包涵体面积与对照组无统计学差异，提示大黄酸对沙眼衣原体无直接灭活作用；在沙眼衣原体感染细胞的不同阶段进行大黄酸处理，发现大黄酸处理46h后沙眼衣原体感染率、包涵体面积及子代效价与阳性对照组有统计学差异，提示大黄酸在沙眼衣原体感染后发挥了抑制作用。 4.转录组测序将样本分为2组（阳性对照组和大黄酸处理组），获得1940个差异基因；GO功能分析差异基因主要富集于黏附连接等蛋白的结合、细胞分裂调控以及氧化应激；KEGG通路分析发现PI3K-AKT信号通路、碳代谢、氨基酸代谢等通路显著富集，大黄酸处理组p-AKT蛋白较感染组表达下调。 研究结论 1.细胞感染模型中大黄酸对沙眼衣原体具有显著的抑制作用。 2.大黄酸与阿奇霉素在体内外可协同抑制沙眼衣原体感染。 3.大黄酸通过与宿主相互作用发挥了抑制沙眼衣原体的作用，RNA-seq分析发现大黄酸抑制机制可能与PI3K-AKT通路下调相关。
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